53-79-2
中文名称
嘌呤霉素二盐酸盐水合物
英文名称
PUROMYCIN
CAS
53-79-2
分子式
C22H29N7O5
分子量
471.51
MOL 文件
53-79-2.mol
更新日期
2024/09/04 14:02:04
![53-79-2 结构式](/CAS/GIF/53-79-2.gif)
基本信息
中文别名
嘌呤酶素嘌呤霉素
嘌呤霉素(源头工厂)
嘌呤霉素二盐酸盐水合物
嘌呤霉素二盐酸盐水合物(嘌呤霉素)
英文别名
1-mm3123l
p-638
C01610
cl16536
cl13,900
nsc-3055
PUROMYCIN
Stylomycin
achromycin
所属类别
原料药:其它抗生素类药物理化学性质
熔点175.5-177°
比旋光度D25 -11° (ethanol)
沸点572.65°C (rough estimate)
密度1.3119 (rough estimate)
RTECS号AU7350000
折射率1.7010 (estimate)
酸度系数(pKa)6.8, 7.2(at 25℃)
形态液体
水溶解性Soluble in water (50 mg/ml at 20°C).
安全数据
警示词警告
危险性描述H302
危险品运输编号3249
危险等级6.1(b)
包装类别III
毒性LD50 in mice (mg/kg): 350 i.v.; 525 i.p.; 675 orally (Porter, 1952)
常见问题列表
理化性质
嘌呤霉素(Puromycin)是由白黑链霉菌(Streptomyces alboniger)发酵代谢产生的一种氨基糖苷类抗生素,分子式C22H29O5N。无色晶体,熔点175~177℃,水溶液对石蕊呈碱性。通过抑制蛋白质合成而杀死革兰氏阳性菌,对革兰氏阳性和阴性细胞以及锥虫、阿米巴原虫和肿瘤细胞等都有抑制作用。嘌呤霉素主治阿米巴感染,也可治疗某些肿瘤病。嘌呤霉素筛选
嘌呤霉素(Puromycin)常用于筛选能够表达pac基因的细胞。pac基因编码嘌呤霉素N-乙酰转移酶(Puromycin N-acetyl-tranferase),如果表达该基因,就会对嘌呤霉素产生抗性。这一特性目前普遍应用于筛选表达pac基因的哺乳动物稳定细胞株。目前,很多商业化的慢病毒载体都携带pac基因(一般在质粒图谱上标记为 puror),可以利用嘌呤霉素的筛选,得到特定基因稳定表达的细胞株。Puromycin不仅能用于稳定细胞株的筛选,也用于稳定细胞株的维持。Puromycin的作用特点是快速作用于细胞,一般2天内可以杀死99%的不表达pac基因的细胞。筛选原理
作用原理是因其具有与tRNA分子中腺苷相连结的氨基酸末端类似的结构, 能够同氨基酸结合,代替氨酰化的tRNA同核糖体的A位点结合,并掺入到延伸的肽链中。虽然嘌呤霉素能够同A位点结合,但是不能参与随后的任何反应, 因而导致蛋白质合成的终止并释放出C-末端含有嘌呤霉素的不成熟的多肽。嘌呤霉素对原核和真核生物的翻译过程均有干扰作用。嘌呤霉素产生菌Streptomyces alboniger内发现的pac基因编码嘌呤霉素N-乙酰转移酶(PAC),赋予机体对嘌呤霉素产生抗性。这一特性如今普遍应用于筛选特定携带pac基因质粒的哺乳动物稳定转染细胞株。很多商业化的慢病毒载体都携带pac基因(一般在质粒图谱上标记为puror),从而利用嘌呤霉素筛选特定基因的稳定表达细胞株。嘌呤霉素也可以用来筛选表达pac基因的大肠杆菌菌株、酵母菌株等。
嘌呤霉素有效筛选浓度跟细胞类型、生长状态、细胞密度、细胞代谢情况及细胞所处细胞周期等均有关。为了筛选到稳定表达的细胞株,确定杀死未转染细胞的最低嘌呤霉素浓度至关重要。初次做实验一定要建立适合自身实验体系的杀灭曲线。若细胞对嘌呤霉素耐受性较高,则可能需要大于常规浓度。
![嘌呤霉素筛选原理 嘌呤霉素筛选原理](/NewsImg/2024-02-29/6384482159787774669484220.png)
相关研究
嘌呤霉素可引起足细胞损伤,机制还不是非常清楚,有研究认为嘌呤霉素可能是通过引起足细胞氧化应激损伤,导致足细胞内氧化还原系统紊乱,超氧化物增加。不过嘌呤霉素仍常常被用来构建肾病大鼠模型,该模型是研究微小病变型肾病(MCNS)和局灶节段性肾小球硬化的理想动物模型l。但是目前尚未见到利用嘌呤霉素体外构建足细胞损伤的模型,特别是利用该模型研究足细胞相关蛋白尿发生的分子机制的报道,而且由于研究目的不同,所用嘌呤霉素的剂量和处理时间也不尽相同。有研究发现45mg/L嘌呤霉素处理48h后,足细胞发生了明显凋亡,而与75mg/L嘌呤霉素相比,尽管处理时间延长了,但是嘌呤霉素的使用剂量减少了近一半,比较经济;同时利用MTT实验检测了45mg/L嘌呤霉素处理48h后足细胞的活力情况,发现足细胞的活力也明显减弱,裂孔隔膜关键分子Nephrin和Podocin的表达发生明显改变,细胞骨架分布紊乱、解聚,因而体外建立嘌呤霉素致足细胞损伤的细胞模型时,使用45mg/L的嘌呤霉素处理小鼠足细胞48h是比较合适的选择。使用方法
1. 建议使用浓度哺乳动物细胞:1-10 μg/mL,最佳浓度需要杀灭曲线来确定;
大肠杆菌:LB琼脂培养基筛选稳定转化pac基因的大肠杆菌,使用浓度为125μg/mL。注:使用嘌呤霉素筛选大肠杆菌稳转株需要精确的pH值调节,而且受宿主细胞本身的影响。
2.溶解方法
用蒸馏水溶解嘌呤霉素配制成50 mg/ml的母液,经0.22 μm滤膜过滤除菌后分装于-20℃冻存;也可溶于甲醇,配制成10 mg/ml的储存液。
3. 嘌呤霉素杀灭曲线的确定(以shRNA转染或者慢病毒转导为例)
嘌呤霉素有效筛选浓度跟细胞类型、生长状态、细胞密度、细胞代谢情况及细胞所处细胞周期位置等有关。为了筛选到稳定表达的shRNA细胞株,确定杀死未转染/转导细胞的最低浓度嘌呤霉素至关重要。建议初次做实验的客户一定要建立适合自身实验体系的杀死曲线(kill curve)。
1)Day 1:24孔板内以5~8 x 104 cells/孔的密度铺板,铺足够量的孔以进行后续的梯度实验。37℃细胞孵育过夜;
2)Day 2:
a)准备筛选培养基:含不同浓度嘌呤霉素的新鲜培养基(如0-15μg/mL,至少5个梯度);
b)往孵育过夜后的细胞内更换新鲜配制的筛选培养基;之后37℃孵育细胞;
3)Day 4:更换新鲜的筛选培养基,并观察细胞存活率。
4)根据细胞的生长状态,约2-3天更换新鲜的筛选培养基;
5)每日监测细胞,观察存活细胞率,从而确定抗生素筛选开始4-6天内有效杀死非转染或者所有非转导细胞的药物最低浓度。
4. 哺乳动物稳定转染细胞株的筛选
等转染含有pac基因的质粒后,细胞在含有嘌呤霉素的培养基中增殖,以筛选出稳定转染子。
1)细胞转染48h后,将细胞(原样或稀释)置于含有适当浓度嘌呤霉素的新鲜培养基中培养。
注意:当细胞处于分裂活跃期时,抗生素作用最明显。细胞过于密集,抗生素产生的效力会明显下降。最好进行细胞分盘使其密度不超过25%。
2)每隔2-3天,移除和更换含有嘌呤霉素的培养基。
3)筛选7天后评估细胞形成的病灶。病灶可能需要额外的一周或者更多时间,这依赖于宿主细胞系和转染筛选效率。注意:每日进行细胞生长状态的观察。嘌呤霉素的筛选至少需要48h,有效浓度嘌呤霉素的筛选周期一般在3-10天。
4)转移和放置5-10个抗性克隆到一个35mm的培养皿中,用选择培养基继续培养7天。此次富集培养是为日后的细胞毒性实验做准备。