胆固醇氧化酶在制药工业和生物农业中都有广泛的用途，用途为：1. 胆固醇氧化酶应用于检测血清或食品中胆固醇含量，与胆固醇脂酶复配，就可以制造临床诊断试剂盒，具有较大的应用市场。2. 胆固醇氧化酶可以降解食品中的胆固醇，在降低胆固醇的同时产生胆甾―4一烯―3―酮，这可以替代化学法和物理法生产低胆固醇保健食品。3. 胆固醇氧化酶可以破坏内消化道上皮细胞，抑制昆虫生长发育，是一种有效的杀灭鳞翅目昆虫的杀虫剂。
胆固醇氧化酶对胆固醇的催化作用有两步: 氧化和异构化, 首先胆固醇氧化酶将胆固醇3 位上的羟基氧化生成羰基.即中间产物五烯三酮, 然后将5 位上的烯烃双键异构成4 位上的烯烃双键, 即终产物胆甾烯酮, 同时将脱下的氢与氧气生成H202。
用诺卡氏菌(Nokarolia sp．NCIB 10554)发酵提取胆固醇氧化酶。