背景[1-3]
MEL-RM人黑色素瘤细胞系是一种来源于人类黑色素瘤的细胞系。黑色素瘤是一种起源于皮肤的恶性肿瘤，其特点是快速生长和转移。MEL-RM细胞系是通过将人类黑色素瘤细胞与小鼠的肉瘤病毒(Rous sarcoma virus)进行基因重组而产生的。
MEL-RM细胞系在实验室研究中被广泛用于研究黑色素瘤的生物学特性、发病机制以及抗肿瘤药物的筛选。此外，MEL-RM细胞系还可以用于研究肿瘤免疫治疗、基因治疗和生物标记物等领域。
MEL-RM细胞系的优点是易于培养、生长迅速且具有较高的生物活性。然而，由于其来源于人类黑色素瘤，因此在某些研究中可能存在伦理问题。此外，MEL-RM细胞系的生物学特性可能因实验室条件和操作方法的不同而有所差异。因此，在进行实验研究时，需要对实验条件进行严格控制以确保结果的可靠性。
MEL-RM人黑色素瘤细胞系
MEL-RM人黑色素瘤细胞系培养操作
1)复苏MEL-RM人黑色素瘤细胞系：以下细胞培养冻存处理仅供参考，具体操作步骤以随货产品说明书为主。
将含有1 mL细胞悬液的冻存管在37℃水浴中迅速摇晃解冻，加4 mL培养基混合均匀。在1000 rpm条件下离心3 min，弃去上清液，加1-2 mL培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液加入含适量培养基的培养瓶中培养过夜（或将细胞悬液加入10 cm皿中，加入约8 mL培养基，培养过夜）。第二天换液并检查细胞密度。
2)MEL-RM人黑色素瘤细胞系传代：如果细胞密度达80%-90%，即可进行传代培养。
a、弃去培养上清，用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次。
b、加1 mL消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培养瓶中，使消化液浸润所有细胞，弃去消化液，将培养瓶置于37℃培养箱中消化1 min，然后在显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆并脱落，迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加少量培养基终止消化。
c、按6-8 mL/瓶补加培养基，轻轻打匀后装入无菌离心管中，1000 rpm离心4 min，弃去上清液，补加1-2 mL培养液后吹匀。
d、将细胞悬液按1:2比例分到新的含8 mL培养基的新皿中或者瓶中，置于培养箱中培养。
3)MEL-RM人黑色素瘤细胞系冻存：待细胞生长状态良好时，可进行细胞冻存。下面T25瓶为例；
a、收集细胞及细胞培养液，装入无菌离心管中，1000 rpm条件下离心4 min，弃去上清液，用PBS清洗一遍，弃尽PBS，进行细胞计数。
b、根据细胞数量加入无血清细胞冻存液，使细胞密度5×106~1×107/mL，轻轻混匀，每支冻存管冻存1mL细胞悬液，注意冻存管做好标识。
c、将冻存管放入-80℃冰箱，24 h后转入液氮灌储存。记录冻存管位置以便下次拿取。
应用[4][5]
MEL-RM人黑色素瘤细胞系可以用于NFATc3在人恶性黑素瘤中的表达及其抑制肿瘤细胞凋亡的作用机制研究
恶性黑素瘤细胞中NFATc3的表达量与其恶性度呈正相关(1)qPCR检测不同品系恶性黑素瘤细胞中NFATc3的mRNA水平,结果显示NFATc3在4种恶性黑素瘤细胞系中的表达均高于正常色素细胞。且其在神经节转移来源的MEL-RM人黑色素瘤细胞系中表达最高,在原位来源的A375细胞中表达相对较低(P<0.01);
(2) 对不同恶性度的黑素瘤细胞进行免疫荧光染色,观察到NFATc3在神经节转移来源MEL-RM人黑色素瘤细胞系中荧光强度明显高于皮肤原位来源A375细胞;上述结果均提示NFATc3在恶性黑素瘤中的表达较正常组织具有显著上调,并且其表达量与恶性程度呈正相关。
CRISPR/Cas9技术构建NFATc3敲减质粒,体外转染并鉴定首先将设计合成的质粒分别转染293T细胞,结果显示转染sg RNA3-NFATc3重组质粒后,其NFATc3表达水平较其他两组显著减低(P<0.01),表明sg RNA3-NFATc3敲减效果最优。将sg RNA3-NFATc3敲减质粒和阴性对照质粒sg RNA-NC转染MEL-RM人黑色素瘤细胞系,转染48 h后,Western blot检测结果显示,敲减组细胞中NFATc3蛋白的表达显著低于对照组(P<0.01),提示sg RNA3-NFATc3敲减的MEL-RM人黑色素瘤细胞系构建成功,可用于后续研究。
NFATc3通过抑制恶性黑素瘤细胞凋亡水平促进其存活及侵袭:1.敲减MEL-RM人黑色素瘤细胞系NFATc3的表达,能降低细胞活性,但不影响细胞增殖:(1)CCK-8检测结果显示,敲减NFATc3后MEL-RM人黑色素瘤细胞系活性明显降低(P<0.01);(2)Ed U染色结果表明,敲减NFATc3后MEL-RM人黑色素瘤细胞系中Ed U阳性细胞较对照组无明显差异(P>0.05);免疫荧光检测可观察到,敲减NFATc3后MEL-RM人黑色素瘤细胞系中PCNA阳性荧光细胞比率与转染阴性质粒的对照组无显著差异(P>0.05)。
2. 敲减NFATc3促进Caspase-8、Caspase-3活化,导致MEL-RM人黑色素瘤细胞系凋亡(1)流式细胞学检测结果显示,敲减NFATc3后Mel-RM凋亡细胞比率增加(P<0.01);(2)TUNEL凋亡染色发现,降低NFATc3的表达后MEL-RM人黑色素瘤细胞系中,TUNEL阳性细胞比率明显增多(P<0.01);(3)免疫荧光检测观察到,敲减组MEL-RM人黑色素瘤细胞系中总Caspase-3阳性荧光信号分布于胞浆中,且阳性细胞比率较对照组明显升高(P<0.01);(4)Western blot检测结果发现,敲减NFATc3可分别在18k Da及17k Da处观察到活化的Caspase-8及Caspase-3蛋白表达明显增加;
3.敲减NFATc3抑制MEL-RM人黑色素瘤细胞系侵袭、迁移能力(1)细胞划痕实验结果显示,敲减NFATc3后,MEL-RM人黑色素瘤细胞系愈合百分比显著减小(P<0.01);(2)Transwell迁移实验结果表明,与对照组相比,敲减NFATc3后细胞穿透小室的数量显著减少(P<0.01);(3)Transwell侵袭实验观察到,敲减组转染MEL-RM人黑色素瘤细胞系24h后,穿透小室的细胞数量较对照组显著减少(P<0.01);
参考文献
[1]YAP activation in melanoma contributes to anoikis resistance and metastasis.[J].Zhao Bei;Xie Jun;Zhou Xiyuan;Zhang Lixia;Cheng Xiankui;Liang Chenglin.Experimental biology and medicine(Maywood,N.J.),2020
[2]Current state of melanoma diagnosis and treatment.[J].Davis Lauren E;;Shalin Sara C;;Tackett Alan J.Cancer biology&therapy,2019
[3]Targeted Therapy and Immunotherapy for Melanoma in Japan.[J].Namikawa Kenjiro;;Yamazaki Naoya.Current treatment options in oncology,2019
[4]NFATc1 promotes prostate tumorigenesis and overcomes PTEN loss-induced senescence.[J].Manda K R;;Tripathi P;;Hsi A C;;Ning J;;Ruzinova M B;;Liapis H;;Bailey M;;Zhang H;;Maher C A;;Humphrey P A;;Andriole G L;;Ding L;;You Z;;Chen F.Oncogene,2016
[5]张婉琪.NFATc3在人恶性黑素瘤中的表达及其抑制肿瘤细胞凋亡的作用机制研究[D].中国人民解放军陆军军医大学,2022.