背景[1-3]
CFPAC-1是一种胰腺管腺癌细胞系，是从一个26岁的白人男性囊性纤维变性（CF）患者的肝转移灶中建立的。这种细胞系表达囊性纤维变性跨膜调节因子（CFTR），并且具有上皮样形态，顶端微绒毛极化。此外，CFPAC-1细胞还表达胰腺管细胞特征性的细胞角蛋白和癌胚抗原，其倍增时间为30-32小时。
CFPAC-1细胞是亚3倍体的细胞系，36%的细胞的染色体模式数为75。这些细胞在传代至24代时可以在免疫抑制小鼠中致瘤。因此，CFPAC-1细胞在医学研究和实验室环境中常被用于模拟和研究胰腺管腺癌的生物学特性，以及评估新药物或治疗方法对胰腺管腺癌的疗效。
CFPAC-1
CFPAC-1培养操作
1)复苏CFPAC-1：以下细胞培养冻存处理仅供参考，具体操作步骤以随货产品说明书为主。
将含有1 mL细胞悬液的冻存管在37℃水浴中迅速摇晃解冻，加4 mL培养基混合均匀。在1000 rpm条件下离心3 min，弃去上清液，加1-2 mL培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液加入含适量培养基的培养瓶中培养过夜（或将细胞悬液加入10 cm皿中，加入约8 mL培养基，培养过夜）。第二天换液并检查细胞密度。
2)CFPAC-1传代：如果细胞密度达80%-90%，即可进行传代培养。
a、弃去培养上清，用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次。
b、加1 mL消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培养瓶中，使消化液浸润所有细胞，弃去消化液，将培养瓶置于37℃培养箱中消化1 min，然后在显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆并脱落，迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加少量培养基终止消化。
c、按6-8 mL/瓶补加培养基，轻轻打匀后装入无菌离心管中，1000 rpm离心4 min，弃去上清液，补加1-2 mL培养液后吹匀。
d、将细胞悬液按1:2比例分到新的含8 mL培养基的新皿中或者瓶中，置于培养箱中培养。
3)CFPAC-1冻存：待细胞生长状态良好时，可进行细胞冻存。下面T25瓶为例；
a、收集细胞及细胞培养液，装入无菌离心管中，1000 rpm条件下离心4 min，弃去上清液，用PBS清洗一遍，弃尽PBS，进行细胞计数。
b、根据细胞数量加入无血清细胞冻存液，使细胞密度5×106~1×107/mL，轻轻混匀，每支冻存管冻存1mL细胞悬液，注意冻存管做好标识。
c、将冻存管放入-80℃冰箱，24 h后转入液氮灌储存。记录冻存管位置以便下次拿取。
应用[4-5]
CFPAC-1可以用于蟾毒灵通过诱导细胞凋亡和细胞周期阻滞在胰腺癌细胞中发挥抗肿瘤作用
蟾毒灵对胰腺癌细胞凋亡的影响及可能的分子机制诱导细胞凋亡是很多抗肿瘤药物抑制肿瘤细胞增殖的重要机制。我们知道,凋亡过程受到凋亡促进分子及凋亡抑制分子的共同调控,其中研究较多的凋亡抑制分子为Bcl-2,而凋亡促进分子为P53,其他与凋亡调控相关的分子有Bax、Bcr-abl及PML-RARa等。近年来,越来越多的报道证明热休克蛋白可以通过调控凋亡信号通路中的关键分子发挥抗凋亡作用。Hsp27是小分子热休克蛋白家族中的一员,它可以在不同的水平影响内源性和外源性凋亡通路抑制细胞的凋亡促进肿瘤的发生发展。因此,研究以Hsp27为靶点的药物对肿瘤的治疗具有重要意义。
如前所述,蟾毒灵可以在多种肿瘤细胞中通过调控不同的分子通路诱导细胞凋亡抑制肿瘤细胞的增殖,而最近的一项研究表明蟾毒灵可以通过靶向抑制Hsp27在骨肉瘤细胞中诱导凋亡。我们感兴趣的是蟾毒灵对胰腺癌细胞凋亡的影响及其作用机制。
选用PANC-1和CFPAC-1两株胰腺癌细胞为模型,以不同浓度的蟾毒灵(OnM,50nM,100nM,200nM)作用于胰腺癌细胞48h,以适当方法收集细胞,用流式细胞术检测细胞凋亡率的改变；利用western blotting技术检测PANC-1和CFPAC-1细胞中凋亡相关蛋白及其上游调控分子表达水平的改变。流式检测结果显示,随着药物浓度的增加,PANC-1和CFPAC-1细胞的凋亡比率增加,即蟾毒灵可以诱导胰腺癌细胞发生凋亡,进而抑制肿瘤细胞的增殖。Western blotting结果表明,经蟾毒灵处理后,Hsp27及其下游分子p-Akt在胰腺癌细胞中下调。
同时,该研究证明,经药物处理后,pro-caspase-3和pro-caspase-9被激活,而Bax表达水平升高,Bcl-2表达下降,即Bax/Bcl-2的比值增高。根据上述实验结果,推测蟾毒灵可能通过抑制Hsp27,进而调控其下游关键的凋亡相关蛋白最终引起细胞发生凋亡。
参考文献
[1]Hsp27 as a Therapeutic Target in Cancers[J].Julie Acunzo;;Claudia Andrieu;;Virginie Baylot;;Alan So;;Palma Rocchi.Current Drug Targets,2014(4)
[2]Reversal effect of bufalin on multidrug resistance in human hepatocellularcarcinoma BEL-7402/5-FU cells[J].Wei Gu;;Long Liu;;Fan-Fu Fang;;Feng Huang;;Bin-Bin Cheng;;Bai Li.Oncology Reports,2014(1)
[3]Cancer statistics,2014[J].Rebecca Siegel;;Jiemin Ma;;Zhaohui Zou;;Ahmedin Jemal.CA A Cancer Journal for Clinicians,2014(1)
[4]Cardiac glycosides block cancer growth through HIF-1α-and NF-κB-mediated Plk1[J].Chuan-Ming Xie;;Xiao-Yu Liu;;Sidney Yu;;Christopher H.K.Cheng.Carcinogenesis,2013(8)
[5]李梅影.蟾毒灵通过诱导细胞凋亡和细胞周期阻滞在胰腺癌细胞中发挥抗肿瘤作用[D].山东大学,2014.