背景及概述[1]
COS-7/非洲绿猴SV40转化的肾细胞源自CV-1细胞株,经带有编码野生型T抗原的起始失活突变的SV40转染得到。COS-7/非洲绿猴SV40转化的肾细胞传代建议:1:2~1:3传代,2~3天换液1次,细胞质检情况:不含细菌、真菌、支原体等微生物污染。COS-7/非洲绿猴SV40转化的肾细胞冷冻及保存方法:
(1)干冰运输,收到后立即转入液氮冻存或直接复苏;
(2)COS-7/非洲绿猴SV40转化的肾细胞存活细胞,收到后应继续生长,传代达到细胞生长状态良好时,再进行冻存。COS-7/非洲绿猴SV40转化的肾细胞培养方法如下:
1)将细胞稀释到1000个细胞/mL,接种到24孔板,每孔1ml。
2)接种后第二天在100ug/mL~1mg/mL的G418浓度范围内进行筛选。
3)每隔3天跟换1次培养液,保持G418浓度不变。
4)选择出在10~14天内使COS-7非洲绿猴SV40转化的肾细胞全部死亡的最低G418浓度来进行下一步的筛选试验。由于每种细胞对G418的敏感性不同,一般变动在100ug/ml~1000ug/ml范围。有研究构建人β防御素-1(hBD-1)稳定表达细胞株,并检测表达产物人p防御素-1对多种多重耐药菌的抗菌活性。方法是将重组质粒pCMV-hBDl通过阳离子脂质体转染于COS-7非洲绿猴SV40转化的肾细胞,经过G418压力筛选后获得单克隆细胞株;提取细胞总RNA,RT-PCR检测目的基因在转录水平的表达;收集细胞培养上清液,Westernblotting检测hBDl基因蛋白的表达;将含有表达产物hBDl的细胞培养上清液分别同各耐药菌液混合,37℃孵育不同时间后涂布于LB平板,以各实验组和对照组的菌落数的比值作为该耐药菌的存活率。
主要参考资料
[1]hBD1稳定表达细胞株的建立及其表达产物对多重耐药菌的活性检测