羊产气荚膜梭菌α毒素抗体检测试剂盒（酶联免疫法）
使用说明书
【产品名称】
通用名：羊产气荚膜梭菌α毒素抗体检测试剂盒（酶联免疫法）
英文名：Test Kit for Antibodies to Alpha-Toxin gene of Clostridium Perfringens（ELISA）
【包装规格】 96T×1/盒、96T×2/盒、96T×5/盒
【预期用途】 羊产气荚膜梭菌病是由产气荚膜梭菌（Clostridium Perfringens）引起的，该菌是动物生存环境中常见的一种梭菌, 它能分解有机质中的糖, 并产生大量气体和毒素, 导致动物机体组织坏死、中毒甚至死亡。感染羊后可引起羔羊痢疾、羊猝疽、肠毒血症等疾病，严重危害养羊业的发展。
本试剂用于检测羊血清中产气荚膜梭菌α毒素抗体，可用于羊三联四防疫苗免疫效果评价。
【原 理】
本试剂盒由预包被产气荚膜梭菌α毒素蛋白抗原的酶标板、酶标记物及其他配套试剂组成，应用酶联免疫法（ELISA）原理检测羊血清、血浆样本中α毒素抗体。实验时在酶标板中加入对照血清和待检样本，经温育后若样品中含有α毒素抗体，则将与酶标板上抗原结合，经洗涤除去未结合的其他成分后；再加入酶标记物，与酶标板上抗原抗体复合物发生特异性结合；再经洗涤除去未结合的酶标记物，在孔中加TMB底物液，与酶标结合物反应形成蓝色产物，显色深浅与样品中的特异性抗体含量成正相关；加入终止液终止反应后，产物变为黄色；用酶标仪在450nm波长测定各反应孔中的吸光值，即可知样品是否含有产气荚膜梭菌α毒素抗体。
【试剂盒组成】
【储存及有效期】 2～8℃保存，有效期12个月。
包被板开封后请于2～8℃避光保存，避免受潮。使用期限为2个月。
【适用仪器】 含450nm、630nm波长的酶标仪，37℃恒温设备，可调微量移液器。
【样品准备】
1.取动物全血按常规方法制备血清，要求血清清亮，无溶血、无污染。样品1周内可于2～8℃保存，长期需置-20℃保存。
2.用样品稀释液将待检血清按50倍稀释（如4μl血清加入196μl样品稀释液中，混匀）。阴、阳性对照不用稀释。
3.浓缩洗涤液使用前应恢复至室温使沉淀溶解，然后用蒸馏水或去离子水作20倍稀释成工作洗涤液(如19份蒸馏水或去离子水+1份浓缩洗涤液)。
【检验方法】
1.使用前将试剂盒置室温30分钟，恢复至室温。
2.取所需用量酶标板条，设阴性/阳性对照各2孔，未用的板条尽快密封，2～8℃保存。
3.阴、阳性对照孔分别加入阴、阳性对照100μl；样品孔每孔加入稀释后的样品100μl。
注：样本稀释比例相当于1:50。
4.混匀，盖好盖板膜,置37℃（推荐水浴）避光反应30分钟。
5.甩去孔内液体，每孔加350μl工作洗涤液，静置30秒后弃去，重复洗涤5次，最后一次拍干。
6.每孔加酶标记物100μl，盖好盖板膜，置37℃避光反应30分钟。
7.洗涤，同步骤5。
8.每孔依次加底物液A、底物液B各50μl，混匀，盖好盖板膜，37℃避光反应10分钟。
9.每孔加终止液50μl，混匀，于450nm(可用630nm作参比波长）测定各孔吸光值（A值）。
【参考值】 实验正常的情况下，阴性对照的平均OD值即ODNC应≤0.3，阳性对照的平均OD值即ODPC应≥0.6。
【检验结果的判定】
1.样品的OD值即ODS；
2.阈值计算：SP值=（ODS-ODNC）/（ODPC-ODNC）；
SP值≥0.2，结果判定为阳性；SP值＜0.2，结果判定为阴性。
3.本实验结果为阴性时表明羊只抗体水平不足，建议补打相应疫苗。
【试验方法的局限性】
该试验仅作为定性检测羊血清、血浆中产气荚膜梭菌α毒素抗体，根据SP值高低可作抗体水平强、中、弱的粗略评估。
【注意事项】
1.实验操作时需戴手套、穿工作衣，严格健全和执行消毒隔离制度，各种实验废弃物都应按传染物处理。
2.终止液具有腐蚀性，应避免接触皮肤和衣物，如不慎接触请立即用大量自来水冲洗。
3.酶标板从冷藏环境中取出时应恢复至室温方可开袋，未用完的酶标板需放入有干燥剂的密封袋中保存。
4.浓缩洗涤液在低温时容易结晶，使用时需恢复至室温以完全溶解。
5.洗涤时各孔均需加满液体，防止孔口有游离酶不能洗净。
6.用于检测的样品应保持新鲜。
7.试验结果的判定必须以酶标仪读数为准。
8.不同批号试剂组分不得混用。