CCK-8试剂盒

Cell Counting Kit-8，简称 CCK-8 试剂盒， 是一种基于 WST-8 而广泛应用于细胞增殖和细胞毒性的快速、高灵敏度、无放射性的比色检测试剂盒。CCK-8 溶液可以直接加入到细胞样品中，不需要预配各种成分。WST-8 在电子耦合试剂存在的情况下，可以被线粒体内的一些脱氢酶还原生成橙黄色 的 formazan (参考图 1) 。细胞增殖越多越快，则颜色越深；细胞毒性越大，则颜色越浅。对于同样的细胞，颜色的深浅 (生成的 formazan  量)  和细胞数目呈线性关系(图 2) 。WST-8 是 MTT 的一种升级替代产品，和MTT 或其它MTT 类似产品，如 XTT、MTS 等相比有明显的优点：①MTT 被线粒体内的一些脱氢酶还原生成的 formazan 不是水溶性的， 需要有特定的溶剂来溶解， 而WST-8 和XTT、MTS 产生的 formazan 都是水溶性的，可以省去后续的溶解步骤；② WST-8 产生的 formazan 比XTT 和MTS 产生的 formazan 更易溶解；③WST-8 比 XTT 和 MTS 更加稳定，使实验结果更可靠；④ WST-8 和MTT、XTT 等相比线性范围更宽， 灵敏度更高，并且更加稳定。 WST-8 对细胞无明显毒性。加入 CCK-8 溶液显色后， 可以在不同时间反复用酶标仪读板，检测时间更加灵活，便于确定测定时间。

操作说明

本试剂盒可以用于细胞因子等诱导的细胞增殖检测，也可以用于抗癌药物等对细胞有毒试剂诱导的细胞毒性检测，或一些药物诱导的细胞生长抑制检测。

1) 制作标准曲线

a. 先用细胞计数板计数所制备的细胞悬液中的细胞数量，然后接种细胞；

b. 按比例依次用培养基等比稀释成一个细胞浓度梯度，一般要做 5-7 个细 胞浓度梯度，每组 4-6 个复孔；

c. 接种后培养 2-4 小时使细胞贴壁，然后每 100 μL 培养基加 10 μL CCK-8 试剂培养一定时间后测定 OD 值，制作出一条以细胞数量为横坐标，OD 值为纵坐标的标准曲线。根据此标准曲线可以测定出未知样品的细胞数量。

2) 细胞活性检测

a. 在 96 孔板中接种细胞悬液 (100 μL/ 孔) ，将培养板放在培养箱中预培养 24 小时；

b. 向每孔加入 10 μL 的 CCK-8  溶液 (注意不要产生气泡) ；

c. 将培养板置于培养箱内孵育 1-4 小时；

d. 用酶标仪测定在 450 nm 处的吸光度。

3) 细胞增殖-毒性检测

a. 在 96 孔板中接种细胞悬液 (100 μL/ 孔) ，将培养板放在培养箱中预培养 24 小时；

b. 向培养板加入不同浓度的待测药物；

c. 将培养板在培养箱孵育一段适当的时间；

d. 向每孔加入 10 μL 的 CCK-8  溶液 (注意不要产生气泡)；

e. 将培养板置于培养箱内孵育 1-4 小时；

f. 用酶标仪测定在 450 nm 处的吸光度。

4) 计算公式

细胞存活率=[(As-Ab) / (Ac-Ab)] × 100%

抑制率=[(Ac-As) / (Ac-Ab)] × 100%

As: 实验孔吸光度 (含细胞、培养基、CCK-8 溶液和药物溶液) ；

Ac: 对照孔吸光度 (含细胞、培养基、CCK-8 溶液，不含药物) ；

Ab: 空白孔吸光度 (含培养基、CCK-8 溶液，不含细胞、药物) 。

 Cell line : HEK293

Medium : DMEM, 10% FBS

Incubation : 37°C, 5% CO 2, 2 hours
Cell line : U87, SK-HEP1 Medium : DMEM, 10% FBS

Chemicals : 200 μM Cisplatin (DDP)

Incubation : 37°C, 5% CO 2, 2 hours

注：如果待测药物有氧化性或还原性，可在加入 CCK-8 之前更换新鲜培养基，去掉待测药物的影响。当待测药物影响比较小的情况下可以不更换培养基，直接扣除培养基中加入待测药物后的空白吸收即可。

保存条件

4°C 一年

-20°C 两年

长期保存，建议避光

注意事项

1） CCK-8 的培养时间一般为 1-4 小时，但在培养 30 分钟左右即可取出肉眼 观察显色程度，根据细胞种类而定，需要摸索条件，

CCK-8 的反应时间以具体显色的时间为准。

2） 使用 96 孔板进行检测时，如果细胞培养时间较长，一定要注意蒸发问题。一方面， 由于 96 孔板周围一圈最容易蒸发，可以采取弃用周围一圈的办法， 改加相同量的PBS、水或培养液；另一方面，可以把 96 孔板置 于靠近培养箱内水源的地方，以缓解蒸发。

3） 本试剂盒的检测依赖于脱氢酶催化的反应，所以还原剂 (例如一些抗氧化剂) 会干扰检测，如果待检测体系中存在较多的还原剂，需设法去除。 用酶标仪检测前需确保每个孔内没有气泡，否则会干扰测定。 4）加入药物中如含有金属，对 CCK-8 显色有影响。终浓度为 1 mM 的氯化亚铅、氯化铁、硫酸铜会抑制 5% 、15% 、90% 的显色反应，使灵敏度降 低。如果终浓度是10 mM 的话，将会 100% 抑制。

5） 培养基中的酚红不会影响实验结果，酚红的吸光度可以在计算时，通过扣除空白孔中本底的吸光度而消去，因此不会对检测造成影响。

6） 本产品可以检测，但不能检测酵母细胞。向 100 μL 培养液中加入 10 μL CCK-8 溶液，并培养 1-4 小时或过夜。

7） CCK-8 试剂对细胞的毒性非常低。它和活细胞内的脱氢酶持续反应使溶液颜色不断加深，OD 值不断增加 (注: 活细胞内的脱氢酶是持续产生的) 。

8） 要测定细胞的具体数量，建议同时做标准曲线。

9） 建议采用多通道移液器，以减小平行孔间的差异。

10） 以下方法可以终止 CCK-8  反应 (96 孔板) ：

a.在显色反应后，将培养板放置 4°C 冰箱内。b.每孔加 10 μL 0.1 M HCl 溶液。(c).  每孔加 10 μL 1% (w/v)  的 SDS (十二烷基硫酸钠) 溶液。

注意：反应停止后，应在 24 小时内测定。

11）本产品仅限于专业人员的科学研究用， 不得用于临床诊断或治疗，不得用于食品或药品。

12）为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。