人肺动脉成纤维原代细胞运输和保存:干冰运输及复苏好存活细胞:(1)1mL冻存管包装干冰运输,收到后-80度冰箱保存过夜后转入液氮或直接复苏,若发现干冰已挥发干净、冻存管瓶盖脱落、破损及细胞有污染,请立即与我们联系。(2)T25瓶复苏的存活细胞常温发货,收到后按照细胞接收后的处理方法操作。
细胞接收后的处理:
1)收到细胞后,75%酒精消毒瓶壁将T25瓶置于37℃培养箱放置约2-3h,若发现培养瓶破损、有液溢出及细胞有污染,请拍照后及时联系我们。
2)请在4或5X显微镜下确认细胞状态,同时给刚收到的细胞拍照(10×,20×)各2-3张以及培养瓶外观照片一张留存,作为售后时收到时细胞状态的依据。
3)贴壁细胞:细胞在37℃培养箱中放置2-3h,显微镜下观察细胞的生长和贴壁情况,有些贴壁细胞在快递运送过程中会因振动脱落和脱落后成团的情况。若镜下观察细胞的生长密度若在60%以下,可去除培养瓶中灌液培养基(若有未贴壁的细胞需要离心回收,重悬打入到原培养瓶中),加入新配制的完全培养基6-8mL,放到细胞培养箱中继续培养。若细胞生长密度达70%-80%以上,可以对细胞进行传代处理。传代过程中,若因运输振动脱落的细胞需要离心回收。
4)备注:运输用的培养基(灌液培养基)不能再用来培养细胞,请换用按照说明书细胞培养条件新配制的完全培养基来培养细胞。 收到细胞后次传代建议T25培养瓶1:2传代 。
一.培养基及培养冻存条件准备:
1)准备DMEM 基础培养基 81%
优质胎牛血清 15 %
GlutaMAX-1谷氨酰胺 1 %
MEM NEAA非必需氨基酸 1%
Sodium Pyruvate丙酮酸钠 1%
P/S青霉素-链霉素 1%
β-巯基乙醇 0.5ul(1000X)
LIF 5ul(10ng/mL)
培养瓶用0.1%明胶包被,或者使用昆明白MEF作为饲养层细胞。
2)培养条件: 气相:空气,95%;二氧化碳,5%。 温度:37℃,培养箱湿度为70%-80%。
3)冻存液:完全培养液 60%%,FBS 30%%,DMSO 10%%现用现配。
我库冻存时,体积为 500 μl,预期存活率 70%,每支冻存管的细胞复苏,3 至4 天后,会形成 30 至 40 个克隆,建议复苏至 1 个 T25 培养瓶中。
二:细胞处理:
人肺动脉成纤维原代细胞铺制:
1. 在 T25 培养瓶中加入 0.2%明胶,摇匀后覆盖底面即可,于 37℃细胞培养箱至少放置 15 min 以上。
2. 吸除 0.2%明胶,加入事先水浴加热至 37℃的 MEF 完全培养液。一般地,一个 T25 培养瓶中加入 5 ml MEF 完全培养液。
3. 按实验需要:小鼠胚胎干细胞使用 KM-r P3 MEF 或 CF-1 P3 MEF;复苏 MEF 细胞若干支。将冻存管从液氮中取出,置于37℃水浴中使之迅速融解,取出后拿到超净台内用 75%酒精擦拭冻存管旋口处及外壁,防止污染。
4. 将冻存管内细胞悬液转移至含 2 ml MEF 完全培养液的 15 ml 离心管内,以1000 rpm,离心 5 min,离心后将上清液吸除,另加入新鲜的 MEF 完全培养液 1 ml,重悬后按照一个 T25 培养瓶铺 1´106 的 MEF 细胞,平均加入到 T25 培养瓶中,轻轻摇匀后置于 37℃细胞培养箱。24 h 以后可以传入小鼠胚胎干细胞
5.复苏或传代小鼠胚胎干细胞前,将 T25 培养瓶中的 MEF 完全培养液吸除,加入 2 ml 小鼠胚胎干细胞完全培养液轻轻冲洗一遍后吸除,加入新鲜的小鼠胚胎干细胞完全培养液待用。
复苏:
1.将人肺动脉成纤维原代细胞冻存管从液氮中取出,置于 37℃水浴中使之迅速融解,取出后拿到超净台内用 75%酒精擦拭冻存管旋口处及外壁,防止污染。
2. 将冻存管内细胞悬液转移至含 3-4 ml 小鼠胚胎干细胞完全培养液的 15 ml 离心管内,以 1000 rpm,离心 5 min。
3. 离心后将上清液吸除,另加入新鲜的小鼠胚胎干细胞完全培养液 2 ml,吹打悬浮。
4. 重复吹打,制成单细胞悬液,尽量避免气泡。
5. 转移至 1 个已经铺好 MEF 细胞的 T25 培养瓶中培养。
6. 每天更换小鼠胚胎干细胞完全培养液。
传代:
1. 一般在复苏后第 2-3 天传代,视克隆大小和密度而定
2. 吸除废液。
3. 用 PBS(不含钙镁离子)轻轻冲洗一遍。
4. 加入 1.0 ml 的 0.25%胰酶(含 EDTA)至培养瓶,轻轻晃动,使胰酶覆盖底面,置于 37℃培养箱内消化细胞。
5. 在显微镜下观察,直至细胞层全部脱落(一般需要 1-2 min)。
6. 加 2 ml 小鼠胚胎干细胞完全培养液终止消化。
7. 以 1000 rpm,离心 5 min,弃上清。
8. 加入约 1 ml 小鼠胚胎干细胞完全培养液,多次轻轻吹打细胞, 制成单细胞悬液。
9. 加入足量的小鼠胚胎干细胞完全培养液,吹打混匀,细胞悬液分装到铺好 MEF 细胞的 T25 培养瓶中。一般地,一个 T25 培养瓶加入 5-6 ml 培养液。放入 37℃培养箱内培养。每天换液。传代比例:1:4-1:7
冻存:
1.按传代的方法将细胞消化下来,制成细胞悬液。
2. 以 1000 rpm,离心 5 min,弃上清,逐滴加入已经预冷的冻存液,悬浮细胞。
3. 按每支存管内加入 500 ml 细胞悬液分装到冻存管内,标记细胞名称、代数、冻存日期等基本信息。
4. 将冻存管置于程序降温盒内,-80℃过夜,转入液氮。冻存液配方:
人肺动脉成纤维原代细胞完全培养液 60%,ES 级 FBS 30%,DMSO 10%
附:分离的简易方法(差速贴壁法):
1.培养中的人肺动脉成纤维原代细胞,按传代的操作方法将细胞用胰酶消化并吹打成单细胞悬液后,加入适量的提前温育好的小鼠胚胎干细胞完全培养液重悬细胞, 吹打混匀,细胞悬液分装到无 MEF 细胞的培养皿或培养瓶(一般地,一个T25 培养瓶中培养的小鼠胚胎干细胞,在一个 10 cm 培养皿中进行差速贴壁。不要事先铺明胶,如铺明胶则细胞贴壁速度过快无法有效分离小鼠胚胎干细胞与 MEF 细胞)中。
2. 培养皿或培养瓶置于 37°C 培养箱内静置 1 小时。
3. 1 小时后,绝大部分 MEF 细胞已贴在培养皿或培养瓶底面,而大部分小鼠胚胎干细胞仍然悬浮在培养液中。收取培养液,进行后续实验。
关键字: 人肺动脉成纤维原代细胞;
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