【艾叶染料法PCR鉴定试剂盒利用PCR原理,定性检测病毒,对病毒引起的疾病诊断及疗效评估有重要指导意义。
【检验原理】
利用离心柱内硅基质膜提取RNA,在反转录酶的作用下,以RNA为模板,以引物为起点合成与RNA模板互补的cDNA链。在TaqDNA聚合酶的作用下,经高温变性、低温退火、中温延伸的循环,使特异DNA片段的拷贝数放大一倍。经过35次循环,最终使扩增DNA片段放大了数百万倍。将扩增DNA片段进行电泳,经染色后,在紫外灯照射下,肉眼可见到DNA片段的扩增带。
【主要组成成份】
组成 | 50T/盒 |
PPRV RT-PCR反应液 | 750 μL×1管 |
PPRV 混合酶液 | 150 μL×1管 |
PPRV 阳性对照 | 40 μL×1管 |
PPRV 阴性对照 | 40 μL×1管 |
说明书 | 1份 |
注:阴性对照为基因组DNA,阳性对照为失去活性的猫冠状病毒cDNA。
【储存条件及有效期】-20℃以下保存,避免反复冻融,有效期12个月。
【需自备的物品】PCR扩增仪、电泳仪、电泳槽、紫外凝胶成像仪、可调移液器、琼脂糖等相关试剂及设备。
【注意事项】
1.病毒具有很强的感染能力,操作前必须准备好各种防御措施。
2.操作时须严格按照步骤进行,废物必须放入含消毒液的废物缸,以免污染实验室和工作人员。
3.为避免其他核酸的污染而出现假阳性,必须使用不含DNA和RNA的离心管、吸管、枪头、试剂和手套,操作人员须戴口罩。
【实验准备】
如果是提取病毒RNA,请选用RNase free Tip枪头和1.5 ml离心管或将枪头和离心管用0.1% DEPC水处理后再使用。
【艾叶染料法PCR鉴定试剂盒操作步骤】
1.样品处理
(1). 适用标本类型:发病动物血液、空肠及小肠肠内容物及组织脏器(肠道组织、肠系膜及淋巴结等)和病毒培养液。
(2). 标本采集,方法如下:
a.血清:用一次性注射器取静脉血2-3ml,转至5ml 的干燥管中,密闭送检。
b.肠内容物:无菌条件下取肠道内容物约1g 左右,置入1ml 含有1.0ml PBS(或生理盐水)的5ml 离心管中,立即送检。
c.组织脏器:取发病动物肠道组织及肠系膜淋巴结等组织约1g,置一1.5ml的洁净离心管中,密闭送检。
(3).应避免标本间交叉污染。
(4).标本收集后可立即检测;若不能立即检测,可置于2~8℃冷藏过夜保存;如需长期保存,标本应冻存于-80℃以下,避免反复冻融。
2. 提取过程
用QIAGEN、Roche公司RNA提取试剂盒提取RNA,具体操作按照其试剂盒说明书操作。
3. RT-PCR扩增
(1)每份总体积20 µL,含15 µL RT-PCR反应液(用前混匀),3µL 混合酶液,2 µL模板RNA。
例如:n份样品,配制n+1份,15×(n+1)RT-PCR反应液, 3×(n+1)混合酶液匀后取18 µL分装成n份,分别加入2 µL模板RNA,作好标记。
(2)在PCR扩增仪上进行以下程序:50 ℃ 10 min,94 ℃ 3 min;循环94℃ 30 s,55 ℃ 30 s,72 ℃ 30 s,共35次;再72 ℃延伸7 min。
4. 电泳
称1.5 g琼脂糖放于500 mL锥形瓶中,加入1倍TAE电泳缓冲液100 mL(取2 mL 50倍TAE电泳缓冲液,用双蒸水稀释至100 mL),于微波炉中熔解,待冷却至50℃左右再加入50 µL染色液(自备)混匀。在电泳槽内放好梳子,倒入琼脂糖凝胶,待凝固后将PCR扩增产物中加入4µL上样缓冲液(自备)混匀后取10 µL点样于琼脂糖凝胶孔中,以110~120V电压于1倍TAE电泳缓冲液中电泳,紫外灯下观察结果。(注:染色液是2000×,上样缓冲液是6×)
【结果判定】
阳性对照出现191 bp扩增带、阴性对照无带出现(引物带除外)时,实验结果成立。被检样品出现艾叶染料法PCR鉴定试剂盒关联产品
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