吡咯啉-5-羧酸合成酶(P5CS)试剂盒说明书
分光光度法 50管/24样
正式测定前务必取2-3个预期差异较大的样本做预测定
测定意义:
脯氨酸是植物体内适应逆境胁迫的一种重要的渗透调节物质。高等植物中脯氨酸代谢因其初始底物不同,分为谷氨酸( Glu) 和鸟氨酸( Orn) 两条合成途径。吡咯啉-5-羧酸合成酶(P5CS, Δ1-pyrroline-5-carboxylate synthetase)是以谷氨酸为前体合成脯氨酸途径的关键酶,对植物适应逆境胁迫起关键作用。
吡咯啉-5-羧酸合成酶(P5CS)试剂盒测定原理:
吡咯啉-5-羧酸合成酶催化谷氨酸生成P5C过程中分解ATP生成ADP和无机磷,通过钼酸铵比色法测定单位时间内产生无机磷的量可确定P5CS活性。
需自备的仪器和用品:
可见外分光光度计、台式离心机、水浴锅、可调式移液器、1mL玻璃比色皿、研钵、冰和蒸馏水。
试剂组成和配制:
试剂一:液体60 mL×1瓶,4℃保存;
试剂二:液体6 mL×1瓶,4℃保存;
试剂三:液体6 mL×1瓶,4℃保存;
试剂四:粉剂×1瓶,4℃保存,用时加入25 mL蒸馏水,溶解后4℃保存一周;
试剂五:粉剂×1瓶,4℃保存,用时加入25 mL蒸馏水,溶解后4℃保存一周;
试剂六:液体25mL×1瓶,室温保存;
试剂七:10mmol/L标准磷贮备液10mL×1瓶,4℃保存。
0.5μmol/mL 标准磷应用液配制:将试剂七 20倍稀释,即取 0.1mL试剂七加1.9mL蒸馏水充分混匀。
定磷剂的配制:按H2O: 试剂四:试剂五:试剂六=2:1:1:1 的比例配制,配好的定磷剂应为浅黄色。若无色则试剂失效,若是蓝色则为磷污染,定磷剂现用现配。
注意:配试剂用新的烧杯、玻棒和玻璃移液器,也可以用一次性塑料器皿,避免磷污染。
样品酶液的制备:
1、组织样品:按照组织质量(g):试剂一体积(mL)为1:5~10的比例(建议称取约0.1g组织,加入1mL试剂一),进行冰浴匀浆。8000g 4℃离心10min,取上清,置冰上待测。
2、血清(浆)样品:直接检测。
吡咯啉-5-羧酸合成酶(P5CS)试剂盒操作步骤:
1、分光光度计或酶标仪预热30min以上,调节波长至660nm。
2、酶促反应(在EP管中加入下列试剂)
| 对照管 | 测定管 |
试剂二(μL) |
| 100 |
样本(μL) |
| 100 |
混匀,37℃(哺乳动物)或25℃(其他物种)准确水浴10min
试剂三(μL) | 100 | 100 |
试剂二(μL) | 100 |
|
样本(μL) | 100 |
|
混匀,8000g,25℃离心10min,取上清液
3、定磷(在EP管或96孔板中加入下列试剂)
| 空白管 | 标准管 | 对照管 | 测定管 |
0.5μmol/ml标准磷应用液(μL) |
| 100 |
|
|
上清液(μL) |
|
| 100 | 100 |
蒸馏水(μL) | 100 |
|
|
|
定磷试剂(μL) | 1000 | 1000 | 1000 | 1000 |
混匀,室温放置30min,在 660nm处,记录各管吸光值。
吡咯啉-5-羧酸合成酶(P5CS)试剂盒注意:
1、由于每一个样都必须做对照,本试剂盒50管保证测 24份P5CS活性。
2、此法具有微量、灵敏、快速的特点。所以对测定所用试管要求严格无磷。
3、空白管和标准管只要做一管。每个测定管设一个对照管。
计算
1、血清(浆)P5CS活力的计算:
单位定义:每小时每毫升血清(浆)中P5CS 消耗ATP 产生1μmol无机磷的量为一个酶活力单位。
P5CS活力(μmol/h/mL)=C标准管×(A测定管-A对照管)÷(A标准管-A空白管)×V总÷V样÷T=9 ×(A测定管-A对照管)÷(A标准管-A空白管)
2、组织中P5CS活力的计算:
(1)按蛋白浓度计算:
单位定义:每小时每毫克组织蛋白中P5CS消耗ATP 产生1μmol无机磷的量为一个酶活力单位。
P5CS活力(μmol/h /mg prot)=C标准管×(A测定管-A对照管)÷(A标准管-A空白管)×V总÷(Cpr×V样)÷T =9 ×(A测定管-A对照管)÷(A标准管-A空白管)÷Cpr
(2)按样本鲜重计算:
单位定义:每小时每克组织中P5CS消耗ATP 产生1μmol无机磷的量为一个酶活力单位。
P5CS活力(μmol/h /g 鲜重)=C标准管×(A测定管-A对照管)÷(A标准管-A空白管)×V总÷(W× V样÷V样总)÷T=9 ×(A测定管-A对照管)÷(A标准管-A空白管)÷W
C标准管:标准管浓度,0.5μmol/mL;V总:酶促反应总体积,0.3mL;V样:加入样本体积,0.1mL ;V样总:加入提取液体积,1mL;T:反应时间,1/6小时;Cpr:样本蛋白质浓度,mg/mL;W:样本鲜重,g。
关键字: 吡咯啉-5-羧酸合成酶(P5CS)试剂盒;吡咯啉-5-羧酸合成酶(P5CS)试剂盒;
上海雅吉生物科技有限公司成立于2011年3月,是一家面向生命科学领域,提供科研类试剂、耗材、仪器、技术服务的生物企业。包括分子生物学、免疫学、微生物学、细胞学等 。旗下拥有 “雅吉生物”、“晶风生物”、“彩佑实业”、“GTX” 品牌。通过公司各部门员工的共同努力在行业内拥有较高知名度,深得新老客户厚爱,本着“优质、服务、信誉”的精神,坚持以优良的技术、优质的产品、良好的信誉为国内外广大用户提供优质生物产品和服务。
公司在重视产品质量的同时,也建立了一套集技术支持,物流售后服务等多部门联动服务体系,努力把我们方便、快捷、周到的服务提供给每一个客户,雅吉生物的试剂盒,在国内众多重点实验室广泛使用,深受广大科研人员好评,先后在权威杂志文章中被引用。
本公司郑重承诺:质量保证、供货及时、服务周到。