中性蛋白酶(Neutral protease, NP)活性测定试剂盒说明书
分光光度法 50管/24样
注 意: 正式测定之前选择2-3个预期差异大的样本做预测定。
中性蛋白酶(Neutral protease, NP)活性测定试剂盒测定意义:
NP在一定的温度和中性pH条件下,催化水解蛋白质。由于其安全无毒、水解能力强、作用范围广等特点,中性蛋白酶常用于食品、饲料、化妆品和营养保健品生产。
测定原理:
中性条件下,NP催化酪蛋白水解产生酪氨酸;在碱性条件下,酪氨酸还原磷钼酸化合物生成钨蓝;在680nm有特征吸收峰。
自备仪器和用品:
可见分光光度计、水浴锅、磁力搅拌器、可调式移液枪、1mL玻璃比色皿、1.5 mL EP管和蒸馏水。
试剂组成和配制:
试剂一:液体90mL×1瓶,4℃保存。
试剂二:粉剂×1瓶,4℃保存。临用前加10 mL蒸馏水溶解。
试剂三:粉剂×1瓶,4℃避光保存。临用前加入20 mL试剂一,沸水浴中磁力搅拌溶解。(可在烧杯上盖一层保鲜膜,注意观察,避免水分全部蒸发,一般加热15-30分钟,该试剂为过饱和试剂,充分混匀后仍出现颗粒物不溶物不影响使用)。
试剂四:粉剂×1瓶, 4℃保存。临用前加50 mL蒸馏水溶解。
试剂五:液体10mL×1瓶,4℃保存。
标准品:液体1mL×1支,0.25 μ mol/mL标准酪氨酸溶液,4℃保存。
中性蛋白酶(Neutral protease, NP)活性测定试剂盒粗酶液提取:
组织:按照组织质量(g):试剂一体积(mL)为1:5~10的比例(建议称取约0.1g组织,加入1mL试剂一)冰浴匀浆,8000g,4℃离心10min,取上清,即粗酶液。
血清或培养液:直接测定。
细菌、真菌:按照细胞数量(104个):试剂一体积(mL)为500~1000:1的比例(建议500万细胞加入1mL试剂一),冰浴超声波破碎细胞(功率300w,超声3秒,间隔7秒,总时间3min);然后8000g,4℃,离心10min,取上清置于冰上待测。
中性蛋白酶(Neutral protease, NP)活性测定试剂盒测定操作:
1.分光光度计预热30min,调节波长到680 nm,蒸馏水调零。
2.试剂二、试剂三和试剂四置于30℃水浴保温30min。
3. 对照管:取一支EP管,加入100μL粗酶液,200μL试剂二,混匀后置于30℃水浴保温10min;加入200μL试剂三,混匀后8000g, 4℃离心10min;取200μL上清液,加入新的EP管,再加入1000μL试剂四,200μL试剂五,混匀后置于30℃水浴保温20min,于680nm测定光吸收,记为A对照管。
4. 测定管:取一支EP管,加入100μL粗酶液,200μL试剂三,混匀后置于30℃水浴保温10min;加入200μL
试剂二,混匀后8000g, 4℃离心10min;取200μL上清液,加入新的EP管,再加入1000μL试剂四,200μL试剂五,混匀后置于30℃水浴保温20min,于680nm测定光吸收,记为A测定管。(注意与空白管不同,先加试剂三,后加试剂二)
5. 空白管:取EP管,加入200μL蒸馏水,1000μL试剂四,200μL试剂五,混匀后置于30℃水浴保温20min,于680nm测定光吸收,记为A空白管。
6. 标准管:取EP管,加入200μL标准品,1000μL试剂四,200μL试剂五,混匀后置于30℃水浴保温20min,于680nm测定光吸收,记为A标准管。
注意:空白管和标准管只需要测定一次。
计算公式:
1. 按照样本蛋白浓度计算
NP活性单位定义:30℃每毫克蛋白每分钟水解产生1nmol酪氨酸为1个酶活单位。
NP活性(nmol/min /mg prot)= C标准品×(A测定管-A对照管)÷(A标准管-A空白管)×V反总÷(Cpr×V1)÷T= 125×(A测定管-A对照管)÷(A标准管-A空白管)÷Cpr
2.按照样本质量计算
NP活性单位定义:30℃每克样品每分钟催化水解产生1 nmol酪氨酸为1个酶活单位。
NP活性(nmol/min /g鲜重)=C标准品×(A测定管-A对照管)÷(A标准管-A空白管)×V反总÷(W×V1÷V2)÷T= 125×(A测定管-A对照管)÷(A标准管-A空白管)÷W
3. 按照液体体积计算
NP活性单位定义:30℃每毫升样品每分钟催化水解产生1nmol酪氨酸为1个酶活单位。
NP活性(nmol/min/mL)=C标准品×(A测定管-A对照管)÷(A标准管-A空白管)×V反总÷V1÷T= 125×(A测定管-A对照管)÷(A标准管-A空白管)
按照细胞数量计算
NP活性单位定义:30℃每104个细胞每分钟催化水解产生1nmol酪氨酸为1个酶活单位。
NP活性(nmol/min /104 cell)=C标准品×(A测定管-A对照管)÷(A标准管-A空白管)×V反总÷(细胞数量×V1÷V2)÷T= 125×(A测定管-A对照管)÷(A标准管-A空白管)÷细胞数量
C标准品:0.25 μ mol/mL标准酪氨酸溶液;V反总:酶促反应总体积,0.5mL;Cpr:粗酶液蛋白质浓度(mg/mL);V1:加入反应体系中粗酶液体积(mL),0.1 mL;V2:提取液总体积(mL),1mL;T:催化反应时间(min),10min;W:样品质量(g)。
注意事项:
临用前配制的试剂配制好后4℃保存,并且3天内使用完毕。
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