NAD-苹果酸酶(Malic enzyme,NAD-ME)试剂盒说明书
分光光度法 50管/48样
注 意:正式测定前务必取2-3个预期差异较大的样本做预测定
NAD-苹果酸酶(Malic enzyme,NAD-ME)试剂盒测定意义:
ME广泛存在于微生物、培养细胞、动物和植物胞浆中,尤其在植物组织中活性较高。ME催化苹果酸氧化脱羧的可逆反应,产生丙酮酸和CO2,以及伴随NAD(P)+的还原反应,是苹果酸代谢的关键酶。ME活性与生物合成和抗氧化密切相关。近年来植物ME活性测定较多,已经成为抗氧化研究的热点。根据辅酶专一性和对底物特异性的不同,可将ME分为NAD-ME(EC1.1.1.38)和NADP-ME(EC1.1.1.40)。
测定原理:
NAD-ME催化NAD+还原成NADH,在340nm下测定NADH增加速率。
需自备的仪器和用品:
紫外分光光度计、水浴锅、台式离心机、可调式移液器、1 mL石英比色皿和蒸馏水。
试剂的组成和配制:
提取液:60mL×1瓶,4℃保存。;
试剂一:液体40mL×1瓶,4℃保存;
试剂二:液体20mL×1瓶,4℃保存;
试剂三:粉剂×1支,4℃保存;用时加2mL蒸馏水充分溶解备用;用不完的试剂分装后-20℃保存,禁止反复冻融。
试剂四:粉剂×1支,-20℃保存;用时加1mL蒸馏水充分溶解备用;用不完的试剂分装后-20℃保存,禁止反复冻融。
样本的前处理:
1、细菌、细胞或组织样品的制备:
细菌或培养细胞:先收集细菌或细胞到离心管内,离心后弃上清;按照细菌或细胞数量(104个):提取液体积(mL)为500~1000:1的比例(建议500万细菌或细胞加入1mL提取液),超声波破碎细菌或细胞(冰浴,功率20%或200W,超声3s,间隔10s,重复30次);8000g 4℃离心10min,取上清,置冰上待测。
组织:按照组织质量(g):提取液体积(mL)为1:5~10的比例(建议称取约0.1g组织,加入1mL提取液),进行冰浴匀浆。8000g 4℃离心10min,取上清,置冰上待测。
2、血清(浆)样品:直接检测。
NAD-苹果酸酶(Malic enzyme,NAD-ME)试剂盒测定步骤:
1、 分光光度计预热30min以上,调节波长至340nm,蒸馏水调零。
2、 将试剂一、二、三和四置于37℃(哺乳动物)或25℃(其它物种)水浴10min以上。如果一次性测定样本较多,可将试剂一、二、三和四按下表比例配成混合液后置于37℃(哺乳动物)或25℃(其它物种)水浴10min以上(现配现用)。
3、 操作表:
试剂名称(μL) | 测定管 |
试剂一 | 600 |
试剂二 | 225 |
试剂三 | 30 |
试剂四 | 15 |
样本 | 30 |
将上述试剂按顺序加入1 mL石英比色皿中,混匀,立即记录 340 nm波长下初始吸光度A1和反应1min后的吸光度A2,计算ΔA=A2-A1。
注意:如果ΔA<0.005,可将反应时间延长到2分钟或5分钟。
NAD-ME活性计算:
(1)按样本蛋白浓度计算:
单位的定义:每mg组织蛋白每分钟生成1 nmol NADH定义为一个酶活力单位。
NAD-ME(nmol/min/mg prot)=[ΔA×V反总÷(ε×d)×109]÷(V样×Cpr) ÷T= 4823×ΔA÷Cpr
此法需要自行测定样本蛋白质浓度。
(2)按样本鲜重计算:
单位的定义:每g组织每分钟生成1 nmol NADH定义为一个酶活力单位。
NAD-ME(nmol/min/g 鲜重)=[ΔA×V反总÷(ε×d)×109]÷(W× V样÷V样总) ÷T = 4823×ΔA÷W
(3)按细菌或细胞密度计算:
单位的定义:每1万个细菌或细胞每分钟生成1 nmol NADH定义为一个酶活力单位。
NAD-ME(nmol/min/104 cell)=[ΔA×V反总÷(ε×d)×109]÷(500×V样÷V样总) ÷T =9.646×ΔA
V反总:反应体系总体积,9×10-4 L;ε:NADH摩尔消光系数,6.22×103 L / mol /cm;d:比色皿光径,1cm;V样:加入样本体积,0.03 mL;V样总:加入提取液体积,1 mL;T:反应时间,1 min;Cpr:样本蛋白质浓度,mg/mL;W:样本质量,g;500:细菌或细胞总数,500万。
关键字: NAD-苹果酸酶(Malic enzym;NAD-苹果酸酶(Malic enzym;
上海雅吉生物科技有限公司成立于2011年3月,是一家面向生命科学领域,提供科研类试剂、耗材、仪器、技术服务的生物企业。包括分子生物学、免疫学、微生物学、细胞学等 。旗下拥有 “雅吉生物”、“晶风生物”、“彩佑实业”、“GTX” 品牌。通过公司各部门员工的共同努力在行业内拥有较高知名度,深得新老客户厚爱,本着“优质、服务、信誉”的精神,坚持以优良的技术、优质的产品、良好的信誉为国内外广大用户提供优质生物产品和服务。
公司在重视产品质量的同时,也建立了一套集技术支持,物流售后服务等多部门联动服务体系,努力把我们方便、快捷、周到的服务提供给每一个客户,雅吉生物的试剂盒,在国内众多重点实验室广泛使用,深受广大科研人员好评,先后在权威杂志文章中被引用。
本公司郑重承诺:质量保证、供货及时、服务周到。