丙酮酸磷酸双激酶(PPDK)试剂盒说明书
分光光度法 50管/48样
注 意 :正式测定前务必取2-3个预期差异较大的样本做预测定
丙酮酸磷酸双激酶(PPDK)试剂盒测定意义:
丙酮酸磷酸双激酶(pyruvate phosphate dikinase, PPDK, EC 2.7.9.1)是C4途径和景天科酸代谢途径的限速酶,催化ATP、丙酮酸和Pi经三步反应生成磷酸烯醇式丙酮酸。该酶主要存在于C4植物的叶绿体基质中,对光合功能具有重要调节作用。
测定原理:
PPDK的逆向反应催化磷酸烯醇式丙酮酸、AMP和PPi生成丙酮酸、ATP和Pi,乳酸脱氢酶进一步催化丙酮酸和NADH生成乳酸和NAD+,在340nm测定NADH减少速率,计算PPDK活性。
需自备的仪器和用品:
紫外分光光度计、台式离心机、可调式移液器、1mL石英比色皿、研钵、冰和蒸馏水。
试剂的组成和配制:
提取液:60mL×1瓶,4℃保存;
试剂一:液体60 mL×1瓶, 4℃保存;
试剂二:粉剂×2瓶,-20℃保存;
试剂三 :液体60μL×1支,4℃保存;体积较少,若沾在管壁上,临用前可低速离心后使用。
样本的前处理:
按照组织质量(g):提取液体积(mL)为1:5~10的比例(建议称取约0.1g组织,加入1mL提取液),进行冰浴匀浆。8000g 4℃离心10min,取上清,置冰上待测。
丙酮酸磷酸双激酶(PPDK)试剂盒测定步骤和加样表:
1、 分光光度计预热30min以上,调节波长至340nm,蒸馏水调零。
2、 样本测定
(1)工作液的配制:临用前取试剂二一瓶加入25mL试剂一和12.5μL试剂三,充分混匀,置于37℃水浴5min;用不完的试剂分装后-20℃保存,禁止反复冻融。
(2)在1mL石英比色皿中加入50μL样本和950μL工作液,混匀,立即记录340nm处初始吸光值A1和37℃反应5min后的吸光值A2,计算ΔA=A1-A2。
丙酮酸磷酸双激酶(PPDK)试剂盒PPDK活性计算:
(1)按样本蛋白浓度计算
单位定义:每mg组织蛋白每分钟消耗1nmol NADH定义为一个酶活力单位。
PPDK(nmol/min/mg prot)=[ΔA×V反总÷(ε×d)×109]÷(V样×Cpr) ÷T=643×ΔA÷Cpr
(2)按样本鲜重计算
单位定义:每g组织每分钟消耗1 nmol NADH定义为一个酶活力单位。
PPDK(nmol/min/g 鲜重)=[ΔA×V反总÷(ε×d)×109]÷(W ×V样÷V样总)÷T=643×ΔA÷W
V反总:反应体系总体积,1×10-3 L;ε:NADH摩尔消光系数,6.22×103 L / mol /cm;d:比色皿光径,1cm;V样:加入样本体积,0.05mL;V样总:加入提取液体积,1 mL;T:反应时间,5 min;Cpr:样本蛋白质浓度,mg/mL;W:样本质量,g。
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