乙醇酸氧化酶(glycollic oxidase, GO)试剂盒说明书
分光光度法50管/48样
注 意 :正式测定之前选择2-3个预期差异大的样本做预测定。
测定意义:
乙醇酸氧化酶(EC1.1.3.15)是植物光呼吸代谢中的关键酶,也是光下合成草酸的关键酶,它催化乙醇酸氧化生成乙醛酸,对研究光呼吸代谢过程及其调控具有重要意义。
乙醇酸氧化酶(glycollic oxidase, GO)试剂盒测定原理:
乙醇酸氧化酶催化乙醇酸氧化生成乙醛酸,乙醛酸和盐酸苯肼反应生成乙醛酸苯腙,在324nm有特征吸收峰。
自备实验用品及仪器:
天平、低温离心机、紫外分光光度计、1mL石英比色皿。
试剂组成和配制:
提取液:液体50mL×1瓶,4℃保存。
试剂一:液体35mL×1瓶,4℃保存。
试剂二:粉剂×1瓶,4℃避光保存,临用前加10mL双蒸水溶解;用不完的试剂分装后-20℃保存,禁止反复冻融。
试剂三:液体5mL×1瓶,4℃保存。
酶液提取:
按照组织质量(g):提取液体积(mL)为1:5~10的比例(建议称取约0.1g组织,加入1mL提取液),进行冰浴匀浆。12000g, 4℃离心10min,取上清,置冰上待测。
乙醇酸氧化酶(glycollic oxidase, GO)试剂盒测定操作表:
| 测定管 |
样本(μL) | 50 |
试剂一(μL) | 650 |
试剂二(μL) | 200 |
试剂三(μL) | 100 |
充分混匀,立即于1mL石英比色皿中测定324nm处10s和190s吸光值A1和A2,△A=A2- A1 |
酶活性计算公式:
1.按照蛋白浓度计算
酶活性定义:每毫克蛋白每分钟氧化1 nmol乙醇酸所需的酶量为一个酶活力单位。
GO活性(nmol/min /mg prot)=
×V反总÷(V样×Cpr)÷T= 392×△A÷Cpr
2.按照样本质量计算
酶活性定义:每克组织每分钟氧化1 nmol乙醇酸所需的酶量为一个酶活力单位。
GO活性(nmol/min /g 鲜重)=
×V反总÷(V样×W÷V样总)÷T= 392×△A÷W
ε:乙醛酸苯腙毫摩尔消光系数:17L/mmol/cm;d:比色皿光径,1cm;V反总:反应总体积,1mL;V样:反应中样本体积,0.05mL;V样总:加入提取液体积,1mL;Cpr:样本蛋白浓度,mg/mL;W,样本质量,g;T:反应时间,3min
注意事项:
1. 测定之前进行预实验,若吸光值较高,请将样品用提取液进行适当的稀释再测定,并在计算公式中乘以稀释倍数。
色素含量较高的样品,可在提取酶时加活性炭
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