单胺氧化酶(Monoamine Oxidase,MAO)试剂盒说明书
分光光度法50管/48样
注 意 :正式测定之前选择2-3个预期差异大的样本做预测定。
单胺氧化酶(Monoamine Oxidase,MAO)试剂盒测定意义:
MAO(EC1.4.3.4) 主要存在于脊椎动物的各种器官,特别是分泌腺、脑、肝脏,在无脊椎动物、豆类的芽等植物中也存在催化单胺类物质代谢,含量较低,具有重要的生理功能,其活性能反映肝纤维化的程度。此外,MAO活性异常导致细胞内单胺类神经递质运转出现紊乱,从而引发多种病症。
测定原理:
MAO催化单胺类底物脱氨生成相应的醛,进一步氧化成酸;底物在360nm处有特征吸收峰,测定360nm光吸收下降的速率,计算MAO活性。
自备实验用品及仪器:
天平、低温离心机、可见分光光度计、1 mL玻璃比色皿、蒸馏水。
试剂组成和配制:
提取液一:液体50mL×1瓶,4℃保存。
提取液二:液体50mL×1瓶,4℃保存。
试剂一:液体100mL×1瓶,4℃保存。
试剂二:液体5mL×1瓶,4℃避光保存。
粗酶液提取:
1. 组织:按照组织质量(g):提取液体积(mL)为1:5~10的比例(建议称取约0.1g组织,加入1mL提取液一)进行冰浴匀浆,10000g,4℃,离心10min,弃沉淀;把上清转移到另一预冷的离心管,10000g,4℃,离心30min,弃上清;加入1.0 mL预冷的提取液二,震荡混匀,16000g,4℃,离心40min,弃上清;沉淀加入预冷的1.0 mL 试剂一,震荡混匀,即粗酶液(可用于可溶性蛋白浓度测定)取上清置于冰上待测。
2. 细菌、真菌:按照细胞数量(104个):提取液体积(mL)为500~1000:1的比例(建议500万细胞加入1mL提取液),冰浴超声波破碎细胞(功率300w,超声3秒,间隔7秒,总时间3min);然后10000g,4℃,离心10min,弃沉淀;把上清转移到另一预冷的离心管,10000g,4℃,离心30min,弃上清;加入1.0 mL预冷的提取液二,震荡混匀,16000g,4℃,离心40min,弃上清;沉淀加入预冷的1.0 mL 试剂一,震荡混匀,即粗酶液(可用于可溶性蛋白浓度测定),取上清置于冰上待测。
3. 血清:直接测定。
测定操作表:
| 空白管 | 测定管 |
酶液(µL) |
| 100 |
试剂一(µL) | 900 | 800 |
试剂二(µL) | 100 | 100 |
混匀,1 mL玻璃比色皿,对照管调零,测定360nm处吸光值A1,然后37℃水浴60min,测定360nm处吸光值A2,△A= A1- A2。 |
注意:空白管只需测定一次。
MAO活性计算公式:
1、按蛋白含量计算
酶活定义:37℃,pH7.6时,每毫克蛋白质1min内转化1nmol底物的酶量为一个酶活单位。
DAO活性(nmol/min / mg prot)= ×V反总÷(V样×Cpr)÷T= 114×ΔA÷Cpr
2、按样本质量计算
酶活定义:37℃,pH7.6时,每克样品1min内转化1nmol底物的酶量为一个酶活单位。
DAO活性(nmol/min / g 鲜重)=×V反总÷(V样÷V样总×W)÷T = 114×ΔA÷ W
3、按照细胞数量计算
酶活定义:37℃,pH7.6时,每104 个细胞1min内转化1nmol底物的酶量为一个酶活单位。
DAO活性(nmol/min / 104 cell)= ×V反总÷(V样÷V样总×细胞数量)÷T
= 114×ΔA÷细胞数量
4、按照液体体积计算
酶活定义:37℃,pH7.6时,每升血清1min内转化1nmol底物的酶量为一个酶活单位。
DAO活性(nmol/min /L)=×V反总÷V样=114000×ΔA
ε:底物摩尔消光系数,1.46 L/mol /cm;d:比色皿光径,1cm;V反总:反应总体积,1mL;V样:反应中样本体积,0.1mL;V样总:加入提取液体积,1mL;Cpr:样本蛋白浓度,mg/mL;T:反应时间,60min,W:样本质量,g
单胺氧化酶(Monoamine Oxidase,MAO)试剂盒注意事项:
1、吸光度变化应该控制在0.01~0.8之间。否则加大样品量或稀释样品,注意计算公式中参与计算的稀释倍数要相应改变。
2、样品蛋白质含量需要另外测定。
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