脱氢酶(dehydrogenase, DHA)试剂盒说明书
分光光度法50管/48样
注 意 :正式测定之前选择2-3个预期差异大的样本做预测定。
脱氢酶(dehydrogenase, DHA)试剂盒测定意义:
脱氢酶(dehydrogenase, DHA) 是一类催化物质氧化还原反应的酶,催化底物通过细胞色素系统被氧化,释放的能量供机体使用,是生物体取得能量的一种方式。
测定原理:
在细胞呼吸过程中,氢受体2, 3, 5 - 氯化三苯基四氮唑(2,3,5-Triphenyl Tetrazolium Chloride, TTC)在脱氢酶作用下接受氢以后,被还原为三苯基甲鐟(Triphenyl Formazone, TF),TF呈现红色,在波长485nm处有吸收峰,采用分光光度法于485nm测定其吸光值,即得脱氢酶活性。
自备实验仪器及用品:
筛子、天平、恒温培养箱或水浴锅、低温离心机、可见分光光度计/酶标仪、微量石英比色皿/96孔板、冰、蒸馏水、甲醇(不允许快递,请用户自备)。
试剂的组成和配制:
提取液:液体50mL×1瓶,4℃保存
试剂一:粉剂×1瓶,使用前加10mL试剂二溶解,4℃避光保存(尽量现配现用)。
试剂二:液体20mL×1瓶,4℃保存。
试剂三:甲醇,自备。
样品处理:
1. 细菌、真菌:按照细胞数量(104个):提取液体积(mL)为500~1000:1的比例(建议500万细胞加入1mL提取液),冰浴超声波破碎细胞(功率300w,超声3秒,间隔7秒,总时间3min);然后8000g,4℃,离心10min,取上清置于冰上待测。
2. 组织:按照组织质量(g):提取液体积(mL)为1:5~10的比例(建议称取约0.1g组织,加入1mL提取液)进行冰浴匀浆,然后8000g,4℃,离心20min。
3. 液体:直接检测。
脱氢酶(dehydrogenase, DHA)试剂盒测定步骤和操作表:
| 空白管 | 测定管 |
样品(μL) |
| 150 |
蒸馏水(μL) | 150 |
|
试剂一(μL) |
| 150 |
试剂二(μL) | 150 |
|
充分混匀,37℃培养24h |
试剂三(μL) | 1350 | 1350 |
振荡1h,8000g,25℃,离心5min,取1mL上清于比色皿,测定A485,△A=A测定-A空白管。空白管只要做一管。 |
脱氢酶活力计算:
标准曲线:y = 0.0422x - 0.0312;R2 = 0.9988;x为标准品浓度(μg/mL),y为吸光值。
1.按照蛋白浓度计算
酶活单位定义:在37℃时,每mg蛋白样品每min催化产生1μgTF为一个酶活性单位。
DHA(μg/ min / mg prot)=(△A+0.0312)÷ 0.0422×V反总÷(Cpr×V样)÷T= 0.181×(△A+0.0312)÷Cpr
2.按照样本质量计算
酶活单位定义:在37℃时,每克样品每min催化产生1μgTF为一个酶活性单位。
DHA(μg/ min /g 鲜重)=(△A+0.0312)÷ 0.0422×V反总÷(W×V样÷V样总)÷T= 0.181×(△A+0.0312)÷W
3. 按液体体积计算
酶活单位定义:在37℃时,每mL样本每min催化产生1μgTF为一个酶活性单位。
DHA(μg/ min /mL)=(△A+0.0312)÷ 0.0422×V反总÷V样÷T= 0.181×(△A+0.0312)
V反总:反应总体积,1.65mL;V样:加入反应体系中样本体积,0.15mL;T:培养时间,1d=1440min;W:样品质量,g; Cpr:蛋白浓度,mg/mL。
注意事项:
配制好的试剂一避光保存于4℃,在一周内使用,若出现红色,则不能使用。
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