丙酮酸脱氢酶(Pyruvate dehydrogenase,PDH)试剂盒说明书
分光光度法50管/48样
注 意:正式测定前务必取2-3个预期差异较大的样本做预测定
丙酮酸脱氢酶(Pyruvate dehydrogenase,PDH)试剂盒测定意义:
PDH(EC 1.2.4.1)广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞中,是丙酮酸脱氢酶复合体(PDHC)催化丙酮酸氧化脱羧的限速酶,催化丙酮酸脱梭生成羟乙基-TPP,把糖酵解和三羧酸循环连接起来。
测定原理:
PDH催化丙酮酸脱氢,同时还原2,6-二氯酚靛酚(2,6-DCPIP),从而导致600nm光吸收的减少。
需自备的仪器和用品
可见分光光度计、水浴锅、台式离心机、可调式移液器、1 mL玻璃比色皿、研钵、冰和蒸馏水。
试剂的组成和配制:
试剂一:50mL×1瓶,-20℃保存;
试剂二:10mL×1瓶,-20℃保存;
试剂三:1mL×1支,-20℃保存;
试剂四:液体50mL×1瓶,4℃保存;
试剂五:粉剂×1支,4℃保存;
试剂六:粉剂×1支,4℃保存;
试剂七:粉剂×1支,4℃保存;
试剂八:粉剂×1支,4℃保存;
工作液的配制:临用前把试剂五、试剂六、试剂七和试剂八转移到试剂四中混合溶解待用;用不完的试剂分装后-20℃保存,禁止反复冻融。
样本的前处理:
组织、细菌或细胞中胞浆蛋白与线粒体蛋白的分离:
1、 称取约0.1g组织或收集500万细菌或细胞,加入1mL试剂一和10uL 试剂三,用冰浴匀浆器或研钵匀浆。
2、 将匀浆600g,4℃离心5min。
3、 弃沉淀,将上清液移至另一离心管中,11000g,4℃离心10min。
4、 上清液即胞浆提取物,可用于测定从线粒体泄漏的PDH(此步可选做)。
5、 在步骤④的沉淀中加入200uL试剂二和2uL 试剂三,超声波破碎(冰浴,功率20%或200W,超声3秒,间隔10秒,重复30次),用于线粒体PDH活性测定。
丙酮酸脱氢酶(Pyruvate dehydrogenase,PDH)试剂盒测定步骤:
1、 分光光度计预热30min以上,调节波长至605nm处,蒸馏水调零。
2、工作液于37℃(哺乳动物)或25℃(其它物种)中孵育5min。
3、在1mL玻璃比色皿中加入50μL样本和900μL工作液,混匀,立即记录605nm处初始吸光值A1和1min后的吸光值A2,计算ΔA=A1-A2。
PDH活性计算:
(1) 按样本蛋白浓度计算
单位的定义:每mg组织蛋白每分钟消耗1 nmol 2,6-二氯酚靛酚定义为一个酶活性单位。
PDH活性(nmol/min /mg prot)=[ΔA×V反总÷(ε×d)×109]÷(V样×Cpr) ÷T=905×ΔA÷Cpr
(2) 按样本鲜重计算
单位的定义:每g组织每分钟消耗1 nmol 2,6-二氯酚靛酚定义为一个酶活性单位。
PDH活性(nmol/min/g 鲜重)=[ΔA×V反总÷(ε×d)×109]÷(W× V样÷V样总) ÷T=182.8×ΔA÷W
(3) 按细菌或细胞密度计算
单位的定义:每1万个细菌或细胞每分钟消耗1 nmol 2,6-二氯酚靛酚定义为一个酶活性单位。
PDH活性(nmol/min /104 cell)=[ΔA×V反总÷(ε×d)×109]÷(500×V样÷V样总)÷T=0.366×ΔA
V反总:反应体系总体积,9.5×10-4 L;ε:2,6-二氯吲哚酚摩尔消光系数,2.1×104 L / mol /cm;d:比色皿光径,1cm;V样:加入样本体积,0.05 mL;V样总:加入提取液体积,0.202 mL;T:反应时间,1 min;Cpr:样本蛋白质浓度,mg/mL;W:样本质量,g;500:细菌或细胞总数,500万。
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