几丁质酶（Chitinase）试剂盒说明书
分光光度法50管/24样
注 意：正式测定之前选择2-3个预期差异大的样本做预测定。
几丁质酶（Chitinase）试剂盒测定意义：
几丁质主要存在于虾、蟹、昆虫等甲壳类动物的外壳与软体动物的器官(例如乌贼的软骨)，以及真菌类的细胞壁中。而几丁质酶(EC 3.2.1.14)可催化几丁质水解，具有抵御真菌侵染的作用，成为抗真菌病害的研究热点。
测定原理：
几丁质酶水解几丁质产生N-乙酰氨基葡萄糖，进一步与对二甲氨基苯甲醛产生红色化合物，在585nm处有特征吸收峰，吸光值增加速率反映了几丁质酶的活性。
自备实验用品及仪器：
天平、水浴锅、离心机、可见分光光度计、1 mL玻璃比色皿，蒸馏水。
试剂组成和配制：
提取液：液体100mL×1瓶，4℃保存。
试剂一：液体10mL×1瓶，4℃保存。
试剂二：液体10mL×1瓶，4℃保存。（若出现结晶，可80℃左右加热溶解后使用）
试剂三：液体10mL×1瓶，4℃保存。
试剂四：液体20mL×1瓶，4℃避光保存。
粗酶液提取：
1. 组织：按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为1：5~10的比例（建议称取约0.1g组织，加入1mL提取液）进行冰浴匀浆，然后10000g，4℃离心20min，取上清，置冰上待测。
2. 真菌：按照细胞数量（104个）：提取液体积（mL）为500~1000：1的比例（建议500万细胞加入1mL提取液），冰浴超声波破碎细胞（功率300w，超声3秒，间隔7秒，总时间3min）；然后10000g，4℃，离心20min，取上清置于冰上待测。
3. 培养液：直接测定。
几丁质酶（Chitinase）试剂盒测定操作表：
| 对照管 | 测定管 |
粗酶液（µL） | 400 | 400 |
提取液（µL） | 600 | 200 |
试剂一（µL） |
| 400 |
混匀，37℃水浴1h |
试剂二（µL） | 200 | 200 |
混匀，沸水浴7min，5000rpm，4℃，离心10min，取上清1000µL。 |
试剂三（µL） | 200 | 200 |
试剂四（µL） | 400 | 400 |
混匀，37℃，15min，蒸馏水调零，1mL玻璃比色皿，测定A585，ΔA=A测定-A对照。 |
计算公式：
标准曲线：y=0.3088-0.003，R2=0.9995
计算公式：
1、 按照样本重量计算
酶活性定义：37℃条件下，每克组织每小时分解几丁质产生1mg N-乙酰氨基葡萄糖的酶量为一个酶活性单位。
几丁质酶活性（mg/h/g鲜重）=（ΔA+0.003）÷0.3088×V反总÷(V样÷V样总×W) ÷T
=8.096×（ΔA +0.003）÷W
2、 按照蛋白质浓度计算
酶活定义：37℃条件下，每毫克蛋白每小时分解几丁质产生1mgN-乙酰氨基葡萄糖的酶量为一个酶活单位。
几丁质酶活性（mg/h mg prot）=（ΔA+0.003）÷0.3088×V反总÷(V样×Cpr) ÷T
= 8.096×（ΔA +0.003）÷Cpr
3、 按细胞数量计算
酶活定义：37℃条件下，每104个细胞每小时分解几丁质产生1mgN-乙酰氨基葡萄糖的酶量为一个酶活单位。
几丁质酶活性（mg/h /104 cell）=（ΔA+0.003）÷0.3088×V反总÷(V样÷V样总×细胞数量)
=8.096×（ΔA +0.003）÷细胞数量
4、按液体体积计算
酶活定义：37℃条件下，每毫升培养液每小时分解几丁质产生1mg N-乙酰氨基葡萄糖的酶量为一个酶活单位。
几丁质酶活性（mg/h /mL）=（ΔA+0.003）÷0.3088×V反总÷V样=8.096×（ΔA +0.003）
V反总：反应体系总体积，1mL；V样：反应体系中样本体积，0.4mL；V样总：加入提取液体积，1mL；W：样本质量，g；Cpr：样本蛋白浓度，mg/mL
注意事项：
1、 反应结束后立即进行比色。
2、 试剂四有一定的毒性，请操作时做好防护措施。
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