内切-β-1,4-葡聚糖酶(Cx)活性测定试剂盒说明书
分光光度法50管/24样
注 意 :正式测定前务必取2-3个预期差异较大的样本做预测定
内切-β-1,4-葡聚糖酶(Cx)活性测定试剂盒测定意义:
Cx(EC3.2.1.4)存在于细菌、真菌和动物体内,是纤维素酶系的组份之一,Cx主要作用于非晶态纤维素和水溶性纤维素衍生物,随机水解糖苷键,将其分解成葡萄糖、纤维二糖、纤维三糖和其他寡聚体。
测定原理:
采用3,5-二硝基水杨酸法测定Cx催化羧甲基纤维素钠降解产生的还原糖的含量。
需自备的仪器和用品:
可见分光光度计、水浴锅、离心机、可调式移液器、1mL玻璃比色皿、研钵、冰和蒸馏水。
试剂的组成和配制:
提取液:液体50mL×1瓶,4℃保存;
试剂一:液体15mL×1瓶,4℃保存;
试剂二:液体60mL×1瓶,4℃保存;
样品测定的准备:
1、细菌或培养细胞:先收集细菌或细胞到离心管内,离心后弃上清;按照细菌或细胞数量(104个):提取液体积(mL)为500~1000:1的比例(建议500万细菌或细胞加入1mL提取液),超声波破碎细菌或细胞(冰浴,功率20%或200W,超声3s,间隔10s,重复30次);8000g 4℃离心10min,取上清,置冰上待测。
2、组织:按照组织质量(g):提取液体积(mL)为1:5~10的比例(建议称取约0.1g组织,加入1mL提取液),进行冰浴匀浆。8000g 4℃离心10min,取上清,置冰上待测。
3、血清(浆)样品:直接检测。
内切-β-1,4-葡聚糖酶(Cx)活性测定试剂盒测定步骤:
1、 分光光度计预热30min以上,调节波长至540nm,蒸馏水调零。
2、加样表(在EP管中依次加入下列试剂):
试剂名称(μL) | 测定管 | 对照管 |
样本 | 50 | 50 |
试剂一 | 500 |
|
蒸馏水 |
| 500 |
混匀,37℃准确水浴2h
混匀, 90℃水浴10min(盖紧,防止水分散失),冷却后,测540nm下吸光值A,计算ΔA=A测定管
-A对照管。每个测定管需设一个对照管。
Cx活性计算:
1、标准条件下测定回归方程为y = 6.4078x - 0.0673;x为标准品浓度(mg/mL),y为吸光值。
2、血清(浆)Cx活力的计算
单位的定义:每mL血清(浆)每分钟催化产生1μg 葡萄糖定义为一个酶活力单位。
Cx活力(μg /min/mL)= [1000×(ΔA+0.0673) ÷6.4078×V反总]÷V样÷T
=14.305×(ΔA+0.0673)
3、细胞、细菌和组织中Cx活力的计算
(1)按照蛋白浓度计算
单位的定义:每mg组织蛋白每分钟催化产生1μg 葡萄糖定义为一个酶活力单位。
Cx活力(μg /min/mg prot)=[ [1000×(ΔA+0.0673) ÷6.4078×V反总]÷(V样×Cpr) ÷T
=14.305×(ΔA+0.0673) ÷Cpr
(2)按样本鲜重计算
单位的定义:每g组织每分钟催化产生1μg 葡萄糖定义为一个酶活力单位。
Cx活力(μg /min /g鲜重)=[1000×(ΔA+0.0673) ÷6.4078×V反总]÷(W× V样÷V样总) ÷T
=14.305×(ΔA+0.0673) ÷W
(3)按细菌或细胞密度计算
单位的定义:每1万个细菌或细胞每分钟催化产生1μg 葡萄糖定义为一个酶活力单位。
Cx活力(μg /min /104 cell)=[1000×(ΔA+0.0673) ÷6.4078×V反总]÷(500×V样÷V样总) ÷T
=0.0286×(ΔA+0.0673)
1000:1mg/mL=1000ug/mL;V反总:反应体系总体积,0.55mL; V样:加入样本体积,0.05 mL;V样总:加入提取液体积,1 mL;T:反应时间,120 min;Cpr:样本蛋白质浓度,mg/mL;W:样本质量,g;500:细菌或细胞总数,500万。
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