糖化酶(Glucoamylase)试剂盒说明书
分光光度法50管/24样
注 意 :正式测定之前选择2-3个预期差异大的样本做预测定。
糖化酶(Glucoamylase)试剂盒测定意义:
糖化酶,即葡萄糖淀粉酶(EC3.2.1.3),又称γ-淀粉酶,是一种外切型糖苷酶,它从淀粉的非还原性末端水解α-1,4糖苷键和α-1,6糖苷键,将淀粉完全水解为葡萄糖,因此广泛的应用于酒精、白酒、抗生素、氨基酸、有机酸,甘油,淀粉糖等工业中,是我国重要的工业酶制剂之一。
测定原理:
糖化酶水解可溶性淀粉生成葡萄糖,与3,5-二硝基水杨酸生成红棕色化合物,在540nm处有光吸收,在一定范围内反应液颜色深浅与葡萄糖的量成正比,可测定计算得糖化酶的活力。
自备实验用品及仪器:
天平、低温离心机、可见分光光度计、1 mL玻璃比色皿、恒温水浴锅。
试剂组成和配制:
提取液:液体50mL×1瓶,4℃保存。
试剂一:液体25mL×1瓶,4℃保存。
试剂二:液体25mL×1瓶,4℃避光保存。
糖化酶(Glucoamylase)试剂盒酶液提取:
1. 组织:按照质量(g):提取液体积(mL)为1:5~10的比例(建议称取约0.1g,加入1mL提取液)加入提取液,冰浴匀浆后于4℃,10000g离心10min,取上清置于冰上待测。
2. 细胞:按照细胞数量(104个):提取液体积(mL)为500~1000:1的比例(建议500万细胞加入1mL提取液),冰浴超声波破碎细胞(功率300w,超声3秒,间隔7秒,总时间3min);然后4℃,10000g离心10min,取上清置于冰上待测。
3. 培养液或其它液体:直接检测。
测定操作:
| 对照管 | 测定管 |
样本(μL) |
| 50 |
灭活样本(μL) | 50 |
|
试剂一(μL) | 500 | 500 |
充分混匀,40℃反应20min |
试剂二(μL) | 450 | 450 |
混匀,沸水浴5min,自来水冷却后,于1mL玻璃比色皿,蒸馏水调零,测定540nm处吸光值A,△A=A测定管-A对照管 |
酶活性计算公式:
标准曲线:y = 0.2164x - 0.0182,R2 = 0.9992
1. 按照蛋白含量计算
酶活性定义:在40℃,pH4.6条件下,每毫克蛋白每分钟分解可溶性淀粉产生1mg葡萄糖所需的酶量为一个酶活力单位。
糖化酶活性(U/mg prot)=(△A+0.0182)÷ 0.2164×V反总÷(V样×Cpr)÷T
= 2.54×(△A+0.0182)÷ Cpr
2. 按照样本质量计算
酶活性定义:在40℃,pH4.6条件下,每克组织每分钟分解可溶性淀粉产生1mg葡萄糖所需的酶量为一个酶活力单位。
糖化酶活性(U/g 鲜重)=(△A+0.0182)÷ 0.2164×V反总÷(W×V样÷V样总)÷T
= 2.54×(△A+0.0182)÷ W
3.按照液体体积计算
酶活性定义:在40℃,pH4.6条件下,每毫升培养液每分钟分解可溶性淀粉产生1mg葡萄糖所需的酶量为一个酶活力单位。
糖化酶活性(U/mL)=(△A+0.0182)÷ 0.2164×V反总÷V样÷T
= 2.54×(△A+0.0182)
4. 按照细胞数量计算
酶活性定义:在40℃,pH4.6条件下,每104个细胞每分钟分解可溶性淀粉产生1mg葡萄糖所需的酶量为一个酶活力单位。
糖化酶活性(U/104cell)=(△A+0.0182)÷ 0.2164×V反总÷(V样×细胞数量(万个)÷V样总)÷T
= 2.54×(△A+0.0182)÷ 细胞数量(万个)
V反总:反应总体积,0.55mL,V样:反应体系中加入样本体积,0.05mL;V样总:加入提取液体积,1mL;Cpr:样本蛋白浓度,mg/mL;W:样本质量,g;T:反应时间,30min
注意事项:
1. 灭活样本的制备建议将样本放在沸水浴中煮沸10min,以将酶彻底灭活。
2. 测定之前进行预实验,若吸光值较高,请将样品用提取液进行适当的稀释再测定,并在计算公式中乘以稀释倍数。
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