糖化酶(Glucoamylase)试剂盒说明书
分光光度法50管/24样
注 意 ：正式测定之前选择2-3个预期差异大的样本做预测定。
糖化酶(Glucoamylase)试剂盒测定意义：
糖化酶，即葡萄糖淀粉酶（EC3.2.1.3），又称γ-淀粉酶，是一种外切型糖苷酶，它从淀粉的非还原性末端水解α-1,4糖苷键和α-1,6糖苷键，将淀粉完全水解为葡萄糖，因此广泛的应用于酒精、白酒、抗生素、氨基酸、有机酸，甘油，淀粉糖等工业中，是我国重要的工业酶制剂之一。
测定原理：
糖化酶水解可溶性淀粉生成葡萄糖，与3,5-二硝基水杨酸生成红棕色化合物，在540nm处有光吸收，在一定范围内反应液颜色深浅与葡萄糖的量成正比，可测定计算得糖化酶的活力。
自备实验用品及仪器：
天平、低温离心机、可见分光光度计、1 mL玻璃比色皿、恒温水浴锅。
试剂组成和配制：
提取液：液体50mL×1瓶，4℃保存。
试剂一：液体25mL×1瓶，4℃保存。
试剂二：液体25mL×1瓶，4℃避光保存。
糖化酶(Glucoamylase)试剂盒酶液提取：
1. 组织：按照质量（g）：提取液体积(mL)为1：5~10的比例（建议称取约0.1g，加入1mL提取液）加入提取液，冰浴匀浆后于4℃，10000g离心10min，取上清置于冰上待测。
2. 细胞：按照细胞数量（104个）：提取液体积（mL）为500~1000：1的比例（建议500万细胞加入1mL提取液），冰浴超声波破碎细胞（功率300w，超声3秒，间隔7秒，总时间3min）；然后4℃，10000g离心10min，取上清置于冰上待测。
3. 培养液或其它液体：直接检测。
测定操作：
| 对照管 | 测定管 |
样本（μL） |
| 50 |
灭活样本（μL） | 50 |
|
试剂一（μL） | 500 | 500 |
充分混匀，40℃反应20min |
试剂二（μL） | 450 | 450 |
混匀，沸水浴5min，自来水冷却后，于1mL玻璃比色皿，蒸馏水调零，测定540nm处吸光值A，△A=A测定管-A对照管 |
酶活性计算公式：
标准曲线：y = 0.2164x - 0.0182，R2 = 0.9992
1. 按照蛋白含量计算
酶活性定义：在40℃，pH4.6条件下，每毫克蛋白每分钟分解可溶性淀粉产生1mg葡萄糖所需的酶量为一个酶活力单位。
糖化酶活性（U/mg prot）=（△A+0.0182）÷ 0.2164×V反总÷（V样×Cpr）÷T
= 2.54×（△A+0.0182）÷ Cpr
2. 按照样本质量计算
酶活性定义：在40℃，pH4.6条件下，每克组织每分钟分解可溶性淀粉产生1mg葡萄糖所需的酶量为一个酶活力单位。
糖化酶活性（U/g 鲜重）=（△A+0.0182）÷ 0.2164×V反总÷（W×V样÷V样总）÷T
= 2.54×（△A+0.0182）÷ W
3.按照液体体积计算
酶活性定义：在40℃，pH4.6条件下，每毫升培养液每分钟分解可溶性淀粉产生1mg葡萄糖所需的酶量为一个酶活力单位。
糖化酶活性（U/mL）=（△A+0.0182）÷ 0.2164×V反总÷V样÷T
= 2.54×（△A+0.0182）
4. 按照细胞数量计算
酶活性定义：在40℃，pH4.6条件下，每104个细胞每分钟分解可溶性淀粉产生1mg葡萄糖所需的酶量为一个酶活力单位。
糖化酶活性（U/104cell）=（△A+0.0182）÷ 0.2164×V反总÷（V样×细胞数量（万个）÷V样总）÷T
= 2.54×（△A+0.0182）÷ 细胞数量（万个）
V反总：反应总体积，0.55mL，V样：反应体系中加入样本体积，0.05mL；V样总：加入提取液体积，1mL；Cpr：样本蛋白浓度，mg/mL；W：样本质量，g；T：反应时间，30min
注意事项：
1. 灭活样本的制备建议将样本放在沸水浴中煮沸10min，以将酶彻底灭活。
2. 测定之前进行预实验，若吸光值较高，请将样品用提取液进行适当的稀释再测定，并在计算公式中乘以稀释倍数。
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