酰基转移酶(alcohol acyl transferase,AAT)活性测定试剂盒说明书
分光光度法25管/24样
注 意:正式测定之前选择2-3个预期差异大的样本做预测定。
酰基转移酶(alcohol acyl transferase,AAT)活性测定试剂盒测定意义:
AAT是一个多功能蛋白大家族,主要负责催化生物体内各种酰基化和去酰基化反应,在基因表达、代谢和信号传导中具有重要作用。
测定原理:
AAT催化乙酰CoA转移乙酰基到丁醇,释放的CoA还原DTNB生成TNB;TNB在412nm有吸收峰,测定412 nm吸光度增加速率可计算AAT活性。
自备仪器和用品:
研钵、冰、台式离心机、可见分光光度计、1mL玻璃比色皿、恒温水浴锅、无水乙醇。
试剂组成和配制:
提取液:液体25mL×1瓶,4℃保存;
试剂一:液体25mL×1瓶,4℃保存;
试剂二:粉剂×1瓶,-20℃保存。
试剂三:粉剂×1支,4℃避光保存。
粗酶液提取:
1. 组织:按照组织质量(g):提取液体积(mL)为1:5~10的比例(建议称取约0.1g组织,加入1mL提取液)进行冰浴匀浆。8000g,4℃离心10min,取上清置冰上待测。
2. 细菌、真菌:按照细胞数量(104个):提取液体积(mL)为500~1000:1的比例(建议500万细胞加入1mL提取液),冰浴超声波破碎细胞(功率300w,超声3秒,间隔7秒,总时间3min);然后8000g,4℃,离心10min,取上清置于冰上待测。
3. 液体:直接检测。
酰基转移酶(alcohol acyl transferase,AAT)活性测定试剂盒AAT测定操作:
1、分光光度计预热30min,调节波长到412 nm,蒸馏水调零。
2、工作液的配制:临用前在试剂二瓶中加入22.5mL试剂一,充分混匀待用。用不完的试剂分装后-20℃保存,禁止反复冻融。
3、试剂三的配制:临用前加无水乙醇1.25mL充分溶解待用,用不完的试剂4℃保存。
4、 空白管:在Ep管或96孔板中加入50μL提取液和900μL工作液,充分混匀,35℃反应15min,加入50μL试剂三,充分混匀,25℃静置10min,测定412nm处吸光值,记为A空白管。
5、 测定管:在Ep管或96孔板中加入50μL样本和900μL工作液,充分混匀,35℃反应15min,加入50μL试剂三,充分混匀,25℃静置10min,测定412nm处吸光值,记为A测定管。△A=A测定管- A空白管,空白管只要做一管。
AAT活性计算公式:
(1)按照蛋白浓度计算
活性单位定义:每毫克蛋白每分钟催化产生1nmol TNB定义为一个酶活单位。
AAT (nmol/min /mg prot) = △A ÷(
×d)×V反总÷(V样×Cpr)÷T = 98.04×△A÷Cpr
(2)按照样本质量计算
活性单位定义:每克组织每分钟催化产生1nmol TNB定义为一个酶活单位。
AAT (nmol/min /g 鲜重) = △A ÷(
×d)×V反总÷(W×V样÷V样总) ÷T = 98.04×△A÷W
(3)按细胞数量计算
活性单位定义:每104个细胞每分钟催化产生1nmol TNB定义为一个酶活单位。
AAT (nmol/min /104cell) = △A ÷(
×d)×V反总÷(细胞数量×V样÷V样总) ÷T
= 98.04×△A÷ 细胞数量
(4)按液体体积计算
活性单位定义:每毫升样品每分钟催化产生1nmol TNB定义为一个酶活单位。
AAT (nmol/min /mL) = △A ÷(
×d)×V反总÷V样÷T =98.04×△A
:TNB消光系数,13600L/mol/cm;V反总:反应总体积,1mL;V样:加入反应体系中上清液体积,0.05mL;V样总:加入提取液体积,1mL;Cpr:蛋白含量,mg/mL;W:样本质量,g;T:反应时间,15 min。
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