磷脂酶A2(phospholipase A2,PLA2)试剂盒说明书
分光光度法50管/24样
注 意:正式测定之前选择2-3个预期差异大的样本做预测定。
磷脂酶A2(phospholipase A2,PLA2)试剂盒测定意义:
磷脂酶A2(EC3.1.1.4)是磷脂sn-2位脂酰基水解酶,广泛存在于动植物组织、细菌、细胞核分泌物中,参与脂肪消化,精子成熟、细胞信号传递、脂质过氧化修复、宿主反应等生理过程,在控制体内磷脂类物质平衡、调节机体新陈代谢、参与疾病的病理进程等方面发挥着及其重要的作用。
测定原理:
磷脂酶A2作用于2-硫代十六酰乙基磷酸胆碱(HEPC)产生游离巯基,与DTNB反应生成黄色物质,在412nm处有特征吸收峰。
自备实验用品及仪器:
天平、超速冷冻离心机、研钵、可见分光光度计、1 mL玻璃比色皿。
试剂组成和配制:
提取液:液体50mL×1瓶,4℃保存。
试剂一:液体50mL×1瓶,4℃保存。
试剂二:液体50mL×1瓶,4℃保存。
试剂三:液体×5瓶,-20℃避光保存。临用前根据用量每瓶加入4.5mL试剂二充分混匀;用不完的试剂分装后-20℃保存,禁止反复冻融。
样品处理:
1. 组织:按照质量(g):提取液体积(mL)为1:5~10的比例(建议称取约0.1g,加入1mL提取液)加入提取液,冰浴匀浆后于4℃,10000g离心5min,取全部上清于4℃、100000g离心30min,弃上清,取沉淀溶于1mL试剂一。
2. 细胞:按照细胞数量(104个):提取液体积(mL)为500~1000:1的比例(建议500万细胞加入1mL提取液),冰浴超声波破碎细胞(功率300w,超声3秒,间隔7秒,总时间3min);然后于4℃,10000g离心5min,取全部上清于4℃、100000g离心30min,弃上清,取沉淀溶于1mL试剂一。
3. 血清:直接测定。
磷脂酶A2(phospholipase A2,PLA2)试剂盒测定操作:
| 对照管 | 测定管 |
样品(μL) | 100 | 100 |
试剂二(μL) | 900 |
|
试剂三(μL) |
| 900 |
充分混匀,37℃反应10min,于1mL玻璃比色皿,蒸馏水调零,测定412nm处吸光值,记为A对照管和A测定管,△A=A测定管- A对照管 |
计算公式:
1.按照蛋白浓度计算
酶活性定义:每毫克蛋白每分钟水解HEPC产生1nmol游离巯基所需的酶量为一个酶活力单位。
PLA2活性(nmol/min/mg prot)= △A÷(
×d)×V反总÷(V样×Cpr)÷T
= 73.53×△A÷Cpr
2.按照样本质量计算
酶活性定义:每克组织每分钟水解HEPC产生1nmol游离巯基所需的酶量为一个酶活力单位。
PLA2活性(nmol/min/g 鲜重)= △A÷(
×d)×V反总÷(W×V样÷V样总)÷T
= 73.53×△A÷W
3. 细胞数量计算
酶活性定义:每104个细胞每分钟水解HEPC产生1nmol游离巯基所需的酶量为一个酶活力单位。
PLA2活性(nmol/min/104 cell)= △A÷(
×d)×V反总÷(V样×细胞数量÷V样总)÷T
= 73.53×△A÷细胞数量
4按照液体体积计算
酶活性定义:每毫升血清每分钟水解HEPC产生1nmol游离巯基所需的酶量为一个酶活力单位。
PLA2活性(nmol/min/mL)= △A÷(
×d)×V反总÷V样÷T
= 73.53×△A
:TNB消光系数,13600L/mol/cm;d:比色皿光径,1cm;V反总:反应总体积,1mL;V样:反应体系中加入样本体积,0.1mL;W:样本质量,g;V样总:加入提取液体积,1mL;
T:反应时间,10min
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