乙酰辅酶A羧化酶(Acetyl-CoA carboxylase,ACC)试剂盒说明书
分光光度法50管/24样
注 意:正式测定前务必取2-3个预期差异较大的样本做预测定
乙酰辅酶A羧化酶(Acetyl-CoA carboxylase,ACC)试剂盒测定意义:
ACC在生物体内催化乙酰辅酶A羧化生成丙二酰辅酶A,是脂肪酸和许多次生代谢产物合成的关键酶。ACC的活性在一定程度上决定了脂肪酸的合成速度和含油量的高低。
测定原理:
ACC能够催化乙酰辅酶A、NaHCO3和ATP生成丙二酰辅酶A、ATP和无机磷,通过钼酸铵定磷法测定无机磷的增加量来测定ACC活性。
需自备的仪器和用品:
分光光度计、恒温水浴锅、台式离心机、可调式移液器、1 mL玻璃比色皿、研钵、冰和蒸馏水。
试剂的组成:
提取液:60mL×1瓶,4℃保存;
试剂一:20mL×1瓶, 4℃保存;
试剂二:粉剂×1瓶,4℃保存;
试剂三:粉剂×1瓶,-20℃保存;
试剂四:粉剂×1 瓶, 4℃保存。用时加入25mL蒸馏水,溶解后4℃可保存一周。
试剂五:粉剂×1瓶, 4℃保存。用时加入25mL蒸馏水,溶解后4℃可保存一周。
试剂六:液体 25mL×1 瓶,室温保存。
试剂七:10μmol/mL 标准磷贮备液 10mL×1 瓶,4℃保存。
样本的前处理:
1、细菌或培养细胞:先收集细菌或细胞到离心管内,离心后弃上清;按照细菌或细胞数量(104个):提取液体积(mL)为500~1000:1的比例(建议500万细菌或细胞加入1mL提取液),超声波破碎细菌或细胞(冰浴,功率20%或200W,超声3s,间隔10s,重复30次);8000g 4℃离心10min,取上清,置冰上待测。
2、组织:按照组织质量(g):提取液体积(mL)为1:5~10的比例(建议称取约0.1g组织,加入1mL提取液),进行冰浴匀浆。8000g 4℃离心10min,取上清,置冰上待测。
乙酰辅酶A羧化酶(Acetyl-CoA carboxylase,ACC)试剂盒测定步骤:
1、 分光光度计预热30min以上,调节波长至660nm,蒸馏水调零。
2、 酶促反应试剂的配制和预热:在试剂二瓶中加入6.5mL试剂一,充分溶解混匀;在试剂三瓶中加入5mL蒸馏水,充分溶解混匀;将试剂一、二、三在37℃(哺乳动物)或25℃(其它物种)预热10分钟。
3、定磷试剂的配制:按H2O: 试剂四:试剂五:试剂六=2:1:1:1 的比例配制,配好的定磷试剂
应为浅黄色,若无色则试剂失效,若是蓝色则为磷污染,定磷剂现用现配。
注意:配试剂用新的烧杯、玻棒和玻璃移液器,也可以用一次性塑料器皿,避免磷污染。
4、0.5μmol/mL 标准磷应用液配制:将试剂七20倍稀释,即取 0.5mL试剂七加9.5蒸馏水,充分混匀。
5、酶促反应
试剂名称(μL) | 对照管 | 测定管 |
试剂一 | 450 |
|
试剂二 |
| 250 |
试剂三 |
| 200 |
样本 | 50 | 50 |
37℃(哺乳动物)或25℃(其它物种)准确反应30min后,90℃水浴5min(盖紧,以防止水分散失),冷却后,10000g 25℃离心5min,取上清
6、定磷
| 标准管 | 空白管 | 对照管 | 测定管 |
0.5μmol/mL标准磷应用液 | 100 |
|
|
|
蒸馏水 |
| 100 |
|
|
上清液 |
|
| 100 | 100 |
定磷试剂 | 900 | 900 | 900 | 900 |
混匀,37℃(哺乳动物)或25℃(其它物种)水浴30min,冷却至室温,在 660nm处,蒸馏水调零,记录各管吸光值A。标准管、空白管只要做一次即可,每个测定管需要设一个对照管。
注意:若测定管吸光值大于2,将样品用提取液稀释适当倍数后再进行测定,使吸光值小于2,可提高检测灵敏度,计算公式中乘以相应稀释倍数。
ACC活性计算:
1、按组织蛋白浓度计算:
定义:每小时每毫克组织蛋白产生1μmol无机磷的量为一个 ACC活力单位。
ACC (μmol/h/mg prot)=(C标准管×V总)×(A测定管-A对照管)÷(A标准管-A空白管)÷
(V样×Cpr)÷T=10×(A测定管-A对照管)÷(A标准管-A空白管)÷Cpr
2、按样本鲜重计算:
定义:每小时每g组织产生1μmol无机磷的量为一个 ACC活力单位。
ACC (μmol/h/g鲜重)=(C标准管×V总)×(A测定管-A对照管)÷(A标准管-A空白管)÷
(W× V样÷V样总)÷T=10×(A测定管-A对照管)÷(A标准管-A空白管)÷W
3、 按细菌或细胞密度计算:
定义:每小时每500万细菌或细胞产生1μmol无机磷的量为一个 ACC活力单位。
ACC (μmol/h/104 cell)=(C标准管×V总)×(A测定管-A对照管)÷(A标准管-A空白管)÷
(500× V样÷V样总)÷T=0.02×(A测定管-A对照管)÷(A标准管-A空白管)
C标准管:标准管浓度,0.5μmol/mL;V总:酶促反应总体积,0.5mL;V样:加入样本体积,0.05mL ;V样总:加入提取液体积,1mL;T:反应时间,0.5小时;Cpr:样本蛋白质浓度,mg/mL;W:样本鲜重,g;500:细菌或细胞总数,500万。
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