RNA恒温快速扩增试剂盒（胶体金试纸条型）-99使用说明书
（货号：WLRN8209KIT）
原理概述：
本试剂盒基于一种常温恒温核酸快速扩增技术：在常温恒温下，特殊修饰的反转录酶利用特异性引物和模板RNA合成cDNA链，反应体系中的重组酶、单链DNA结合蛋白和DNA聚合酶以新合成的cDNA链为模板进行快速核酸扩增反应。依赖nfo酶的作用，加入根据模版设计的特异的分子探针，使用胶体金技术（三明治夹心法）可以对最终结果进行检测。
产品特点：
本试剂盒具有灵敏度高、特异性强、反应时间短（仅需12 mins）等优点，反应组分为干粉状态，操作简便，易于保存。
本试剂对设备要求低，金属浴、水浴锅等即可进行反应操作，无需购买PCR扩增仪等价格高昂的专属设备。
引物设计：
建议使用长度在 30-35 bp的引物，引物过短会影响扩增速度和检测灵敏度；下游引物的5’端标记一个修饰基团（常用生物素）。引物设计避免形成二级结构而影响扩增；扩增子长度建议在150-300 bp，通常不超过500 bp。
荧光探针设计：
在上下游引物中间，设计一段长度为46-52nt与目的片段互补的序列；5’端修饰一个抗原标记（典型FAM）; 在5’端和3’末端的中部位置标记一个dSpacer（四氢呋喃，THF），作为nfo的识别位点；3’末端标记一个修饰基团，例如胺基、磷酸基团或C3-Spacer等。
试剂盒组成：
组成 | 含量 |
A buffer | 1.6 mL×1管 |
B buffer | 150 μL×1管 |
试剂 | 48份 |
使用说明书 | 1份 |
试剂盒储存：
运输条件：低温运输；
储存条件：储存温度 ≤ -20 ºC，避光保存，避免重压、反复冻融；
产品有效期：24个月。
操作步骤：提前30分钟将试剂盒所需组分取出，室温融化，震荡混匀。
1) 每个干粉反应管加入29.4 μL A buffer（注意：A buffer需完全融化混匀，否则会对实验效果产生影响）；
2) 每个反应管分别加入2 μL上游引物、2 μL下游引物和0.6 μL探针（引物和探针浓度为10 μM，对于多个反应、步骤1和步骤2可以混合后再分装至反应管中）；
3) 向反应管中依次加入11.5 μL ddH2O和2 μL核酸模板（可根据核酸浓度调整加入的核酸模板体积，并相应调整加入的ddH2O体积，至模板与ddH2O总体积为13.5 μL）；
4) 最后向反应管中加入2.5 μL B buffer并充分混合（对于多个反应，建议将B buffer加至反应管的盖子内侧，上下颠倒反应管8-10次混匀）；
5) 混匀后，将反应液甩（或快速离心）至管子底部，然后立即将反应管放入恒温设备中37-39 ºC孵育8-12 mins；
6) 反应结束后，取10 μL加入含有190 μL ddH2O的离心管中，混合均匀后，将胶体金试纸条的样品端插入离心管中平衡，5 mins内观察质控线与检测线判读结果。
体系配制
组分 | 体积（μL） |
A buffer | 29.4 |
上游引物(10 μM) | 2 |
下游引物(10 μM) | 2 |
探针(10 μM) | 0.6 |
ddH2O和核酸模板 | 13.5 |
B buffer | 2.5 |
总体积 | 50 |
注意事项：
1． 由于试剂盒灵敏度非常高，在进行反应时请注意避免微量核酸污染，并尽量考虑设置空白对照以确认是否有核酸污染。
2． 试剂盒保质期12个月。每次使用时，请取出实验所需的MIRA反应单元的数量，置于冰浴条件下并在8小时内使用；剩余部分，请置于存储条件下。
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关键字： DNA恒温快速扩增试剂盒（基础型），DN;
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