慢病毒包装质粒Mix

产品简介

江苑生物的慢病毒包装质粒Mix（Packaging Mix）为优化的全套慢病毒包装辅助质粒混合物，可以兼容第二代和第三代的慢病毒包装系统。本产品附赠表达eGFP蛋白的对照质粒（eGFP Control），用于验证慢病毒包装效果。本公司还提供慢病毒包装试剂盒（江苑生物 JY03021），包含全套的包装组分和试剂。

Packaging Mix能够表达病毒包装需要的各种必需成分如：gag基因，编码病毒的核心蛋白如基质蛋白、衣壳蛋白和核衣壳蛋白等；pol基因，编码病毒复制所需的酶如反转录酶、整合酶和蛋白酶；rev基因，编码调节gag和pol基因表达的调节因子；还含有单纯疱疹病毒来源的VSV-G基因，提供病毒包装所需要的包膜蛋白。江苑生物的慢病毒包装系统产生的慢病毒为“自杀”性病毒，即病毒感染目的细胞后不会再感染其他细胞，也不会利用宿主细胞产生新的病毒颗粒。慢病毒中的毒性基因已经被剔除并被外源性目的基因所取代，属于假型病毒。

本产品具有慢病毒包装时间周期短（一周之内即可获得纯化好的高滴度慢病毒）和病毒滴度高的优势，可应用于针对不同基因和药物靶标的细胞学实验和整体动物实验。非常适合于病毒包装初试者。为了加速科研进程，江苑生物还提供细胞基因过表达、shRNA/siRNA介导的基因沉默、CRISPR/Cas9介导的基因敲除等服务。

产品组分

保存条件

干冰运输。-20℃保存, 避免反复冻融，1年有效。

还需准备的其他实验材料

1．被包装的慢病毒载体质粒：在慢病毒包装前，需要先获得含有目的序列的慢病毒载体，以无内毒素高纯度的试剂盒提取慢病毒载体质粒，并将质粒DNA溶于无菌的TE或ddH₂O中，测定其浓度及纯度，保证质粒DNA A260/A280在1.8-2.0之间。

2．慢病毒包装用293T细胞株：良好的细胞状态对病毒的包装至关重要，避免细胞培养基有细菌、真菌或支原体的污染，尽量使用传代次数较少的细胞，如果细胞是刚复苏的话，传两代之后再包装。

3．细胞培养基，血清和双抗等

4．质粒转染试剂

5．其他常用实验耗材（如10 cm培养皿，离心管等）

使用说明（以10 cm培养皿，为例）：

1．293T细胞分盘：转染前一天，将293T细胞以合适的比例传代到10 cm培养皿中，当细胞长到70%-90%时准备转染。

注：细胞要充分消化，成团细胞影响转染效率。

2．转染前换液：转染前将293T细胞换成新鲜培养基，10 mL/10 cm皿。现在的转染试剂例如Lipofectamine 2000、Lipofectamine 3000、LipoSuper（江苑生物 JY03051）和其他转染试剂，多不受血清和抗生素的影响，此处可换为含有血清和抗生素的完全培养基。具体需根据转染试剂的要求换液。

注：293T细胞贴壁性不是很好，换液时应小心滴加尽量避免冲起细胞。

3．转染：Packaging Mix：表达目的序列的慢病毒载体质粒=1：1

★ 以使用LipoSuper（江苑生物 JY03051）转染试剂为例：

取一只无菌的离心管，加入750 μL DMEM（不含血清和抗生素），10 μg表达目的序列的慢病毒载体质粒（自行提供），和13.5 μL Packaging Mix（10 μg），用枪轻轻吹打混匀；再加入24 μL LipoSuper，用枪轻轻吹打混匀，静置5 min，请特别注意不可Vortex或离心。将混合液均匀滴加到提前换液的细胞培养基中，轻轻晃匀，置于培养箱中培养，后续无需在数小时后更换培养液。

注：上述混合液室温存放6 h内稳定。

某些细胞对转染试剂比较敏感，可以在转染后8-12小时更换细胞培养液，转染效率无显著影响。

★ 以使用Lipofectamine 3000（Invitrogen L3000015）转染试剂为例：

取两只无菌的离心管，一只加入500 μL Opti-MEM和32 μL Lipofectamine 3000，用枪轻轻吹打混匀；另一只加入500 μL Opti-MEM 和10 μg表达目的序列的慢病毒载体质粒（自行提供）、13.5 μL Packaging Mix（10 μg）及40 μL P3000试剂，用枪轻轻吹打混匀。将两管液体混合，再次用枪轻轻吹打混匀，不可Vortex或离心，室温孵育10-15 min。将混合液均匀滴加到提前换液的细胞培养基中，轻轻晃匀，置于培养箱中培养，后续无需在数小时后更换培养液。

注：某些细胞对转染试剂比较敏感，可以在转染后8-12小时更换细胞培养液。

Invitrogen的Protocol显示10 cm培养皿Lipofectamine 3000推荐使用21.7 μL或者43.4 μL两种剂量，自行探索哪个剂量更为合适。本实验室在检测该包装质粒时，选用的剂量为32 μL

4．病毒收集：转染36 h左右后，吸取上清至新的离心管中，4℃保存。另外添加10 mL新鲜的完全培养基到细胞中，注意不要冲起细胞。再次大约36 h后，收取上清至同一个离心管中。将两次收集的上清用0.45 μm滤器过滤后转移到新的离心管中（若没有0.45 μm滤器，将上清3000 rpm，4 ℃离心5 min，弃沉淀亦可）。此时上清液中的病毒颗粒可以直接检测滴度或者感染目的细胞，如果对病毒的滴度及纯度有较高要求，可对上清液进行浓缩与纯化。

注：如果使用滤器过滤，只能使用低蛋白结合力的纤维素醋酸酯或聚醚砜（PES）膜，不能用硝酸纤维素膜（NC）。

5．（可选）慢病毒浓缩：可以使用江苑生物的慢病毒浓缩试剂盒（JY03011）进行慢病毒浓缩，效率更高。同时，也可以自行配制PEG-8000慢病毒浓缩液浓缩慢病毒。

注：慢病毒滴度测定方法参考（江苑生物官网→新闻中心）

6．病毒分装与保存：将病毒上清或浓缩后的病毒分装，保存于-80℃。

注：病毒液一定要分装，切忌反复冻融，冻融一次病毒滴度将降低20-60%。

图1 江苑生物与**公司慢病毒包装试剂盒包装效率比较

注意事项

1．废弃的含病毒的培养基中加入84消毒液（1:20左右），浸泡1天后丢弃。接触过病毒的枪头，离心管，培养板等其他物品可用84消毒液稀释液处理，也可以用煮沸处理半小时或常规灭菌（121℃，20 min）。

2．本产品仅用于科学研究。

3．为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

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