iFluor 350标记鬼笔环肽

产品简介

鬼笔环肽（Phalloidin）是一种来源于毒蕈类鬼笔鹅膏（Amanita phalloides）的环状七肽毒素，以高亲和力（Kd= 20 nM）选择性结合于丝状肌动蛋白F-actin，而不会与单体肌动蛋白G-actin结合，通常用来标记组织切片，细胞培养物或无细胞体系中的F-actin，从而对F-actin进行定性和定量分析。另外，鬼笔环肽衍生物也以相近的亲和力结合于大小纤维，无论是动植物来源的肌肉细胞或非肌肉细胞，按照每一个肌动蛋白亚基约与一个鬼笔环肽分子的计量比结合。且非特异性结合几乎可忽略，染色区域和非染色区域辨识度非常明显。因此，鬼笔环肽衍生物特别适合替代肌动蛋白（Actin）抗体进行相关研究。另外鬼笔环肽衍生物很小，直径约12-15Å，分子量＜2000 Daltons，未标记肌动蛋白（Actin）的许多生理特性都得以维持，比如，同肌动蛋白结合蛋白如肌球蛋白，原肌球蛋白，DNase I等仍能发生反应；鬼笔环肽标记的纤维丝仍可穿透固相肌球蛋白基质；以及甘油抽提的肌纤维标记后仍可收缩等。

本品为iFluor 350标记的鬼笔环肽,可发出高亮度、稳定的一种亮红色荧光染料,染色反应特异性强,对比性高,适合用作F-actin的定性和定量检测。与Actin抗体比较,iFluor 350鬼笔环肽具有如下优点:1)与actin亚单位一比一结合,并且不与G-actin结合,具有比Actin抗体更好的染色效果;2)且本品的结合没有物种差异性,适用性广泛;3)鬼笔环肽标记的非特异性信号可忽略,因而图像的反差较好;4)染色与用于细胞分析的其他荧光染色完全兼容,包括荧光蛋白、Qdot 纳米晶体和其他iFluor偶联物(包含iFluor偶联二抗);5)经本品结合后的F-actin仍能维持actin自身具有的许多生物学特性。

操作步骤

1.母液及工作液配制 

母液准备：对于iFluor 350标记鬼笔环肽。本品以冻干粉形式提供，冰箱取出后先进行回温，300T规格加入300ul的1×PBS缓冲液,即可得到300ul存储母液，建议根据单次使用量，对母液进行小量分装，-20℃避光冻存，一年稳定。4℃避光保存，3个月稳定。

工作液准备：开始实验前，使用1×PBS缓冲液稀释储存液到需要的工作浓度。推荐工作浓度为：1:40～1:200。工作液现配现用。按照1：200比例来计算，即1ul体积的iFluor 350标记鬼笔环肽溶液中加入200ul的1×PBS缓冲液浓度，可进行300次细胞染色。【注】：稀释比可根据实际实验效果适当调整。

2.  染色步骤

1：细胞爬片生长24h，使其密度达到50%汇合度。

2：吸掉培养液，37℃预热的1×PBS（pH 7.4）清洗细胞2次。

3：使用溶于PBS的4%甲醛溶液进行细胞固定，室温固定10min。 【注意】：避免固定剂中含有甲醇成分，因为甲醇在固定过程中可能破坏肌动蛋白。

4：室温条件下，用PBS清洗细胞2~3次，每次10min。

5：室温条件下，用丙酮（≤-20℃）脱水或者用0.5% Triton X-100溶液透化处理5min。

6：室温条件下，用PBS清洗细胞2~3次，每次10min。

7：取200µl配制好的iFluor 350标记鬼笔环肽工作液，覆盖住盖玻片上的细胞，室温避光孵育30min（通常情况下，4℃~37℃孵育皆可）。 注意：为了降低背景，可于iFluor 350标记的鬼笔环肽工作液内加入1% BSA；另外，孵育过程中为了避免溶液挥发，可将盖玻片转移到一个密封的容器内。

8：用PBS清洗盖玻片3次，每次5min。

9：使用200µl DAPI溶液（浓度：100 nM）对细胞核进行复染，约30s。

10： 用PBS清洗盖玻片，然后倒置在已经滴有一滴Fluoromount-GTM 水溶性封片剂的载玻片上。使用纸巾轻轻檫掉多余封片剂，然后用指甲油永久封片。此法制备的标本玻片可置于4℃避光保存，通常6个月内可继续做F-actin染色分析。

11： 荧光显微镜或者共聚焦显微镜下进行荧光观察，选择iFluor 350激发/发射滤片（Ex/Em=347/448 nm）和DAPI激发/发射滤片（Ex/Em=364/454nm）。

注意事项

1）鬼笔环肽具有毒性，需小心操作（对人的半数致死剂量LD50约2mg/kg）。

2）为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

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