中文名：mRNA Cap 2´-O-Methyltransferase
英文名：mRNA Cap 2´-O-Methyltransferase
纯度：医药级
货号：C406452
包装：2.5ku
存储温度：-20°C储存
产品介绍：
产品基本信息
来源：携带牛痘病毒mRNA帽结构2'-O-甲基转移酶基因的E.coli菌株。
反应条件：1× Capping Reaction Buffer (50 mM Tnis-HC1, pH 8.0; 5 mMKCl; 1 mMMgCl; 1 mM DTT),37C孵育
储存缓冲液：20mM Tnis-HCl pH8.0;100mMNaC1; 1mMDTT;0.1mM EDTA;0.1%TritonX-100; 50%(vv)Glycerol
产品描述
体外转录获得的mRNA未经细胞内一系列修饰，不具备Cap 结构与PolyA 尾，容易降解，易激活免疫反应，不能与核糖体起始蛋白结合，无法启动蛋白翻译，因而在工业化mRNA生产中，需使用牛痘病毒加帽酶对IVT 的mRNA进行加帽修饰，使mRNA的5' 端获得Cap0 结构，进一步使用2'-O- 甲基转移酶将Cap0 转化为Cap1。酶法加帽引入的帽结构与真核生物体内天然帽结构完全一致，从根本上降低外源mRNA 免疫原性的同时，保护其不被降解，并提高翻译效率，增加细胞内蛋白产量。通过酶法加帽最大可获得100%的加帽效率，而通过化学合成帽类似物结构加帽，其加帽效率相对较低，并且帽类似物结构与天然帽结构有差异。
mRNA Cap 2´-O-Methyltransferas 可利用 S-腺苷甲硫氨酸（SAM）作为甲基供体， 在 RNA 5´末端紧邻帽结构（Cap 0）的第一个核苷酸的 2´-O 上添加甲基基团，形成带有 Cap 1 结构的 mRNA。Cap1 结构能增强 mRNA 的翻译效率，从而可提高转染后 mRNA 编码的蛋白表达水平。该酶只能以带 7-甲基鸟苷帽结构（m7GpppN）的 RNA 为底物，不会作用于 5´末端为pN、ppN、 pppN 或 GpppN 的 RNA。带 7-甲基鸟苷帽结构（m7GpppN）的 RNA 可通过 Vaccinia Capping System（Cat. No: GMP-M062, Novoprotein）来制备。
本制品利用大肠杆菌大规模发酵表达，采用药用规格原辅料生产，并严格控制宿主蛋白质残留、核酸残留等，符合 GMP 规范的产品生产与质量管理规程保障生产过程及所有原辅料可追溯。
图1. mRNA 帽结构 2´ -O-甲基转移酶作用机理。mRNA 的帽结构是由一个7-甲基鸟苷通过一个5′–5′三磷酸酯桥连接到mRNA 链的5′核苷上组成。Cap-0 结构由相邻的RNA 链通过三种酶的依次反应形成。进一步形成cap-1 结构需要2′O 甲基转移酶的参与，该修饰可以降低RNA 在体内引起的细胞先天免疫反应。本图引自Decroly, E., Ferron, F., Lescar, J. et al. (2012). Conventional and unconventional mechanisms for capping viral mRNA. Nat Rev Microbiol 10, 51-65
质量要求
| 项目 |
标准 |
方法 |
| 外观 |
澄明液体 |
目视检查 |
| 可见异物 |
符合规定 |
中国药典2020版第四部第一法灯检法(通则0904) |
| pH值 |
7.5-8.5 |
中国药典2020版第四部pH值测定法(通则0631) |
| 活性 |
49KUml-51KU/ml |
加帽修饰与效率测定法 |
| 纯度 |
≥95% |
中国药典2020版第四部高效液相色谱法(通则0512) |
| 核酸内切酶残留 |
004-DNA的降解不超过10% |
50U酶与004-DNA.37℃孵育3h |
| 核酸外切酶残留 |
019 HindITI DNA的降解不超过10% |
50U酶与019 HindIII DNA.37℃孵育3h |
| RNA酶残留 |
293-RNA的降解不超过10% |
50U酶与293-RNA. 37℃孵育1h |
| 细曲内毒素含量 |
≤10 EU/mg |
中国药典2020版第四部凝胶限度试验法(通则1143) |
| 外源性DNA残留 |
≤100 pg/mg |
荧光定量PCR法 |
| 宿主蛋白残留 |
≤50 ppm |
中国药典2020版第四部菌体蛋白残留量测定法(通则3412) |
| 支原体检测 |
阴性 |
支原体检测试剂盒 |
| 重金属残留 |
≤10 ppm |
中国药典2020版第四部車金属检査法（通则0821） |
|
遵循以下规范生产
1. ISO 9001:2015, certified facility。
2.《GMP 附录-细胞治疗产品》国家药品监督管理局。
3.《人用基因治疗总论-中国药典 2020》国家药典委。
4. USP Chapter <1043>, Ancillary Materials for Cell, Gene, and Tissue-Engineered Products 用于细胞治疗，基因治疗和组织工程产品中的辅料。
5. USP Chapter <92>, Growth Factors and Cytokines Used in Cell Therapy Manufacturing 细胞治疗产品生产过程中细胞因子和生长因子。
6. Ph. Eur. General Chapter 5.2.12, Raw Materials of Biological Origin for the Production of Cell-based and Gene Therapy Medicinal Products 用于生产细胞或基因治疗药物的生物来源原料。
产品用途
Cap0 结构的 mRNA 2´-O 甲基化（Cap1），以提高 mRNA 的翻译和表达效率。
应用实例
完整mRNA在细胞内表达GFP蛋白，加帽酶与帽类似物对比
注意事项
1. 用于反应的 RNA 在使用之前应进行纯化并溶解于 RNase-free water。溶液中不能含有 EDTA 和盐；
2. 在配置反应体系时，建议使用 RNase 抑制剂以增强反应中 RNA 的稳定性。可以加入 0.5µl 的 RNase 抑制剂（Cat. No: GMP-E125, Novoprotein），同时去掉等体积的 RNase-free water；
3. 反应之前加热 RNA 可以去除 5´端的二级结构。如果转录产物的 5´端结构复杂，可以把加热时间延长至 10 分钟；
4. SAM 在 pH 7–8, 37°C 条件下不稳定，需要在反应开始之前新鲜配置。可事先计算好 SAM 的用量，在反应开始前将 32 mM的储备液稀释成 4 mM 的工作液。为避免 SAM 降解，该工作液需要保存于冰上。
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关键字： mRNA Cap 2′-O-Methyltransferase;mRNA Cap 2′-O-Methyltransferase
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