猪瘟兔化弱毒疫苗病毒探针法荧光定量RT-PCR试剂盒的特点
1. 即开即用，用户只需要提供样品RNA模板。
2. 引物和探针经过优化，灵敏性高。
3. 提供阳性对照，便于区分假阴性样品。
4. 特异性高，不会跟其他病毒的RNA发生交叉反应。
5. 本产品足够 50 次 20μL 体系的探针法荧光定量 RT-PCR 反应。
6. 本产品只能用于科研。
包装规格及成份（具体信息详见説明书，以説明书为准）
| 成份 | 编号 | 十孔盒包装 |
| 探针法 qRT-PCR 缓冲液 | A | 500μL（黄盖） |
| 探针法 qRT-PCR 酶混合液 | B | 100μL（红盖） |
| 荧光 PCR 专用模板稀释液 | C | 1 mL（黄盖） |
| 探针法 qRT-PCR引物混合液 | D | 100 μL（白盖） |
| qRT-PCR 探针 | E | 50 μL（棕色管） |
| 探针法 qRT-PCR阳性对照(1×10E8 拷贝/μL) | F | 50 μL（黄盖） |
| 使用手册 | G | 一份 |
猪瘟兔化弱毒疫苗病毒探针法荧光定量RT-PCR试剂盒使用方法
一、稀释标准曲线样品（以 10E2-10E7 拷贝/μL 这 6 个 10 倍稀释度为例）。由于标准品浓度非常高，因此下列稀释操作一定要在独立的区域进行，
千万不能污染样品或本试剂盒的其他成分）。为增加产品稳定性和避免扩散传染性病原，本产品不提供活体样品做阳性对照，
只提供无传染性的 DNA 片段作为阳性对照。
1. 标记 6 个离心管，分别为 7，6，5，4，3，2。
2. 用带芯枪头分别加入 45 μL 荧光 RT-PCR 专用模板稀释液，最好用带芯枪头，下同）。
3. 在 7 号管中加入 5 μL 1×10E8 拷贝/μL 的阳性对照(试剂盒提供)，充分震荡1分钟，得 1×10E7 拷贝/μL 的标准曲线样品。放冰上待用。
4. 换枪头，在 6 号管中加入 5 μL 1×10E7 拷贝/μL 的阳性对照(上步稀释所得)，充分震荡 1 分钟，得 1×10E6 拷贝/μL 的标准曲线样品。放冰上待用。
5. 换枪头，在 5 号管中加入 5 μL 1×10E6 拷贝/μL 的阳性对照(上步稀释所得)，充分震荡1分钟，得 1×10E5 拷贝/μL 的标准曲线样品。放冰上待用。
6.重复上面的操作直到得到 6 个稀释度的标准曲线样品。放冰上待用。
二、样品 RNA 的制备
7. 如果有N个样品，最好设置N+2个提取，多出的一个是PC（样品制备阳性对照），一个是 NC（样品制备阴性对照）。可以用10μL阳性对照的10000倍稀释
液再加上一定量的水使总体积跟每次制备要求的体积一样，以此作为PC。另外用水作为NC。
8. 用自选方法纯化样品的RNA，本试剂盒跟市场上大多数病毒RNA提取试剂盒兼容。也以选购本公司的柱式病毒RNAout。本试剂盒免费赠送20次免RNA提取
的核酸释放剂试用装，该释放剂的裂解液可以直接作为RT-PCR模板，省略了RNA提取步骤。
三、Probe qRT-PCR 反应（20μL 体系，在样品制备室进行）
9. 如果做定量分析并且只做1次重复，则标记N+9个PCR 管，其中N+2个用于上步得到的 N+2个样品，1个用于PCR阴性对照（用水做模板），6个用于标准曲线。
如果做定性分析，并且只做1次重复，则标记N+4 个PCR管，
其中N+2个用于上步得到的N+2个样品，1 个用于 PCR 阴性对照（用水做模板），
1个用于PCR阳性对照（用第4号管的阳性对照稀释液做模板）。下面只以定量分析为例描述操作步骤。
10. 在标记管中按下表加入各成分（本表只列出一次重复。样品管和阴性对照设置完毕后才设置阳性对照，并且阳性对照样品要等所有管子盖上盖子储存
好后最后加）：
| 成分 | 样品管N+2个 | RT-PCR阴性对照管 | 标准曲线样品管
（2-7 管） |
| 探针法qPCR缓冲液 | 各 10 μL | 10 μL | 各 10 μL |
| 探针法 qPCR 酶混合液 | 各 2 μL | 2 μL | 各 2 μL |
| qRT-PCR探针 | 各 1 μL | 1 μL | 各 1 μL |
探针qRT-PCR
引物混合液 | 各 2 μL | 2 μL | 各 2 μL |
| 待测样品 RNA 模板 | 各 5 μL | -- | -- |
| 超纯水 | -- | 5 μL | -- |
| 第 7 步所得标准曲线样品稀释液（2-7 号） | -- | -- | 各5 μL（2号样到2号管，3号样到3 号管…） |
盖上盖子后上机，按下面参数进行 qRT-PCR：
| 过程 | 温度 | 时间 |
| 逆转录 | 50℃ | 30 min |
| 预变性 | 94℃ | 10 min |
| qRT-PCR 反应（40 个循环） | 94℃ | 15 sec |
| 60℃ | 1 min（采集 FAM 通道的荧光信号）
|
四、数据处理
11.如果把本试剂盒用于定量检测，则以阳性对照浓度的log值为横轴，以Ct值为纵轴，绘制标准曲线。再以待测样品的Ct值从标准曲线上推算出样品核酸浓度的log值，再推算出其浓度。
12.如果把本试剂盒用于定性检测，只判断阳性或阴性，则阴性对照Ct必须大于或等于40。阳性对照必须有荧光对数增长，有典型扩增曲线，Ct值应该小于或等于39。对待测样品，如果其Ct大于或等于40则为阴性，如果小于或等于39则为阳性。如果在39-40之间，则重复一次。重复实验的Ct值如果大于或等于40则为阴性，如果小于40，则为阳性。
猪瘟兔化弱毒疫苗病毒探针法荧光定量RT-PCR试剂盒【储存条件及有效期】
-20℃±5℃，避光保存
有效期 12 个月。
猪瘟兔化弱毒疫苗病毒探针法荧光定量RT-PCR试剂盒注意事项
1操作严格按照说明书进行；
2试剂盒内各种组分使用前应自然融化，完全混匀并短暂离心；
3反应液应避光保存；
4反应中尽量避免气泡存在，管盖需盖紧；
5使用一次性吸头、一次性手套和各区专用工作服；
6样本处理、试剂配制、加样需在不同区进行，以免交叉污染；
7实验完毕后用10%次氯酸或75%酒精或紫外灯处理工作台和移液器；
8试剂盒里所有物品应视为污染物对待，并按照《微生物生物医学实验室生物安全通则》进行处理。
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