DNA恒温快速扩增试剂盒（DNA荧光型）

【产品用途】本产品可应用于核酸DNA 的快速扩增。

【检测原理】本产品是基于重组酶介导链置换核酸扩增（Recombinase-aid Amplification，RAA）技术开发的恒温核酸扩增检测试剂，在39℃恒温条件下特异识别并扩增目标样本的DNA片段，可用Genchek 荧光检测仪实时监控扩增过程，5-20 min 即可完成扩增检测。

【技术原理】重组酶介导链置换核酸扩增（Recombinase-aid Amplification，RAA），是一种恒温核酸快速扩增技术。从细菌或真菌中 获得的重组酶在常温下可与引物DNA紧密结合，形成重组酶/引物复合体，侵入DNA双链核酸模板，在侵入位点重组酶将双链打开，同时单链结合蛋白结合到被重组酶打开的单链上，维持双链模板处于开链状态。重组酶/引物复合体开始对双链进行扫描，当引物在模板上搜索到与之完全匹配的互补序列时，重组酶/引物复合体解体，DNA聚合酶结合到引物的3’端，开始合成新链。合成的新链又可以作为模板，最终扩增产物以指数级增长，完成靶标基因的扩增。经过荧光标记的探针与扩增产物结合，当探针被核酸外切酶酶切后发出荧光信号，可对扩增过程进行实时监控。本试剂盒具有快速、灵敏度高以及特异性强等优点，反应组分已混合并冷冻干燥成反应干粉，操作简便，易于保存。

【引物设计与探针设计】

引物设计建议方法：RAA核酸扩增技术对引物设计的要求与常规PCR引物设计有一定的区别。由两条寡核苷酸组成一对引物，分 别特异性识别一个核酸目标物的上下游核苷酸序列；引物长度在30-35 nt之间，序列中无回文序列、连续单碱基重复序列和内部二级结 构区；引物Tm值不作为设计时主要考虑因素；最佳引物对需通过试验优化筛选得到，要求其扩增产物为单一条带，无非特异性扩增和明显的引物二聚体。

探针设计建议方法：探针序列不与引物识别位点重叠，长度在46-52nt之间，序列避免回文序列、内部二级结构和连续的重复碱基； 共有四个修饰位点，距离5’端的≥28nt的中部位置标记一个dSpacer（四氢呋喃，THF），作为核酸外切酶的识别位点；THF位点的上游标记一个荧光基团，下游标记一个淬灭基团，两个基团的间距为2-4 nt，THF 距离3’末端≥15nt；3’末端标记一个修饰基团，例如胺基、磷酸基团、生物素、生物素-TEG 或C3-spacer。

建议：在开展RAA （荧光型）扩增反应之前，先进行引物的筛选试验，以便得到较高的检测灵敏度。

【产品组成】

【储存条件及有效期】本产品存储于-20±5℃、干燥、避光条件下；有效期为12 个月。

【适用仪器】Genchek 系列荧光检测仪、其他荧光定量PCR 仪（如：ABI 7500 实时荧光定量PCR 仪（软件要求2.0 以上）、Bio-Rad CFX96 Touch 荧光定量PCR 仪或耶拿qTOWER 实时荧光定量PCR 仪等）。

【检测步骤】

1. DNA样本提取：请参考传统DNA 提取方法或其他同效商品化试剂盒提取DNA样本。

2. 样本检测

2.1 单管反应体系（50μL）：  推荐反应体系（模板用量为5μL）：  阳性对照反应体系：

反应干粉          1 管       反应干粉          1 管            反应干粉     1 管

A Buffer          25 μL       A Buffer           25 μL           A Buffer     25 μL

上游引物(10 μM)  2.0 μL       上游引物(10 μM)   2.0 μL           C Buffer     4.6 μL

下游引物(10 μM)  2.0 μL       下游引物(10 μM)   2.0 μL           水          12.9 μL

探针(10 μM)        0.6 μL      探针(10 μM)        0.6 μL             阳性对照      5 μL

DNA样本和水    17.9μL       水               12.9 μL          B Buffer      2.5 μL

B Buffer          2.5μL        DNA样本         5 μL           

B Buffer          2.5μL          总体积       50.0μL 

 总体积         50.0μL          

总体积          50.0μL                                               

2.2 操作步骤

2.2.1 根据反应数量，按照反应体系配制含有水、A Buffer、上游引物(10 μM)、下游引物(10 μM) 、探针（10μM）的Mix，混合均匀后加入装有反应干粉的检测单元管中；

2.2.2 向检测单元管中加入经步骤1处理得到的待测DNA样本；

2.2.3 再向检测单元管盖上加入2.5 μL 的B Buffer，盖上管盖，上下颠倒轻甩充分混匀5-6次，低速离心10 sec；

（注：本步骤“是否充分混匀”将决定实验结果的重复性）

2.2.4 将检测单元管放入 Genchek 荧光检测仪（或其他荧光定量 PCR仪）中，开始检测。

3. 阳性对照反应

3.1 向装有反应干粉的检测单元管中加入25μL A Buffer、4.6 μL C Buffer和12.9 μL 水；

3.2 向检测单元管中加入5.0 μL 阳性对照；

3.3 再向检测单元管盖上加入2.5 μL 的B Buffer，盖上管盖，上下颠倒轻甩充分混匀5-6次，低速离心10 sec；

（注：本步骤“是否充分混匀”将决定实验结果的重复性）

3.4 将检测单元管放入 Genchek 荧光检测仪（或其他荧光定量 PCR仪）中，开始检测。

4. RAA 程序设定

4.1 Genchek 系列荧光检测仪：

4.1.1 开机自检后，点击“扩增”；

4.1.2 放入反应管后点击“新建”，编辑实验名称，然后选择荧光通道“FAM”并选择相应反应孔。点击“启动”；

4.1.3 对反应孔对应的样本信息进行编辑，完成后点击“确定”启动反应。

4.2 其他荧光定量PCR仪：反应体系为50μL体系，荧光通道选择FAM通道。

【结果分析与判定】

1. 结果分析

1.1 Genchek系列荧光检测仪：无需自行设定基线和阈值。

1.2 其他荧光定量 PCR仪：参照具体荧光定量 PCR仪使用说明书进行基线设定和阈值设定。

2. 结果判定

2.1 Genchek 荧光检测仪：可自动判读检测结果。

2.2 其他荧光定量 PCR仪（注：不同荧光定量 PCR仪的判定标准有所差别，可依据实际情况进行调整，以下判定内容仅供参考）：

2.2.1 阳性对照：有典型的扩增曲线出现，出峰时间≤15min（Ct值≤30），为有效结果；

2.2.2 阴性对照：无扩增曲线出现，或出峰时间≥20min（Ct值≥40），为有效结果；

2.2.3 检测样本：有典型的扩增曲线出现，出峰时间≤18min（Ct值≤36）时为阳性；出峰时间＞18min（Ct值＞36）时为阴性。

【注意事项】

1. 在同一核酸提取方法下，不同样品类型所提取的核酸含量和纯度会有明显差异，导致扩增效率不同；

2. 当实验室环境、试剂、仪器或配件存在阳性物质（例如质粒、扩增产物等）污染，或样本间存在交叉污染的情况，则会影响检测结 果准确性，出现假阳性结果；

3. 务必保证试剂保存、配制或运输得当，否则可能导致试剂检测性能下降，出现假阴性结果；

4. 阳性对照核酸应尽快使用，避免反复冻融；

5. 请严格按照本说明书和基因扩增实验室的管理规范进行试验操作；

6. 实验结束后，检测过程中所产生的废弃物应按照相关规范进行处理。

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