柱式无内毒素质粒DNAout
产品及特点 本产品是整合基因柱式质粒 DNAout 和菌体内毒素清除剂两产品而成。菌体内毒素清除剂是天泽基因独家推出的产品,在质粒提取前就把细胞壁上的内毒素清除掉,彻底避免了目前通用的先提取 DNA+内毒素混合物,再从中纯化质粒 DNA 的弊端。用本产品提取的质粒 DNA,内毒素的污染浓度低,适合于转染等对内毒素的污染敏感的实验。
1. 操作简单,只在经典的柱式质粒 DNA 提取前,增加菌体内毒素清除一步。 2. 去内毒素效果好,处理一次可以去除 99%以上的内毒素。 3. 质粒丢失少,产率只比柱式质粒 DNAout 低 5-10%,效果好于先提质粒DNA,再用液相内毒素清除剂处理的方法。 4. DNA 可以直接用于转染等实验。 柱式无内毒素质粒DNAout 规格及成分 成 份 编 号 大纸盒包装 菌体内毒素清除剂 90901 200mL 柱式质粒 DNAout 溶液 A 60205a 13 mL 柱式质粒 DNAout 溶液 B 60205b 13 mL 柱式质粒 DNAout 溶液 C 60205c 18 mL RNase A(10mg/mL) 3160 0.3mL 离心吸附柱 60911 50 套 通用洗柱液 60408 50 mL DNA 洗脱液 2.0 111205 10 mL 使用手册 60205sc 1 份 柱式无内毒素质粒DNAout运输及保存 常温运输及保存,有效期一年。RNase A(10mg/mL)收到样品后需要低温保存。 自备试剂 菌液 使用方法 一: 用菌体内毒素清除剂清除 E.coli 细胞壁上的内毒素。 1. 收集 1.5-5 mL E.coli 饱和菌液,12,000 rpm 离心 1 分钟,弃上清,得到细菌沉淀。 2. 加入 1 mL 菌体内毒素清除剂温和混匀后 10,000-12,000 rpm 离心 1分钟,弃上清(含内毒素)。 3. 一次洗涤(1-2 步)可以去掉 90%以上的内毒素,如果需要,可以再重复上述洗涤操作步骤 3 次,得到的菌体可以直接进入后续的质粒 DNA提取步骤。 二:从无内毒素的 E.coli 中提取质粒 DNA 4. 先将全部 RNase A 溶液全部加入到柱式质粒 DNAout 溶液 A 中,摇匀后再取用,未用完的柱式质粒 DNAout 溶液 A 在 4℃保存。 5. 在第 3 步所得菌液中加入 250 uL 柱式质粒 DNAout 溶液 A,用枪头充分吹打使菌体重悬(此步在冰上操作效果更佳)。注意:细胞未充分悬浮会影响后续操作,可以使用漩涡振荡器帮助混匀或使用 Tip 吸头吹打沉淀至完全混匀。 6. 加入 250 uL 柱式质粒 DNAout 溶液 B(如果溶液 B 有沉淀,用前须37℃加热溶解后冷却到室温方可使用),温和反复颠倒混匀 4-6 次,看到溶液变粘即可,然后冰上放置不超过 4-5 分钟。注意:此步处理不能超过 5 分钟,否则 DNA 的碱损伤比较严重。同时千万不要剧烈振荡, 否则基因组 DNA 断裂产生的片段非常容易污染质粒 DNA。溶液 B 用后需要将盖拧紧存放,否则空气中的二氧化碳会进入溶液,形成碳酸,中和溶液 B 中的 NaOH,降低其效率)。 7. 加入 350 uL 冰上预冷的柱式质粒 DNAout 溶液 C,反复颠倒混匀 4-6次,可见白色沉淀物产生,然后冰上放置至少 5 分钟。 8. 最高转速(12,000 rpm 以上)4℃离心 5 分钟,小心将上清液转移到离心吸附柱中。由于此时的溶液比重较大,有时候出现沉淀漂浮是正常现象,取上清时避开漂浮的沉淀即可。如果此步的离心在室温进行,更容易出现沉淀物漂浮的现象。 9. 静置 2 分钟以让质粒 DNA 与吸附柱充分结合,此步十分重要。 10. 室温 12,000 rpm 离心 1 分钟,弃收集管中的废液。 11. 加入 500 uL 的通用洗柱液,室温 12,000 rpm 离心 1 分钟,弃收集管中废液。注意:通用洗柱液中含乙醇,用后需要将盖拧紧存放,否则乙醇会挥发。 12. 重复上步 1 次。 13. 室温 12,000 rpm 离心 1 分钟,甩干残留液体。此步不能省略,否则残留乙醇会影响 DNA 的后续使用(如 DNA 上样时不能沉淀到加样孔中)。 14. 将离心吸附柱置于一个新的 1.5 mL 塑料离心管(自备)中,加入 30-100uL 65-80℃预热的 DNA 洗脱液 2.0,室温放置 2 分钟。常温的 DNA洗脱液 2.0 也可以用于洗脱,但产量稍微有所降低。 15. 室温 12,000 rpm 离心 1 分钟,离心管底溶液即质粒 DNA。1. 由于的吸附柱结合 DNA 能力较强,如果再加适量 DNA 洗脱液2.0 到离心吸附柱中,往往还能洗脱下很多质粒 DNA(相当于次洗脱的 20-30%),但注意不要使用上步得到的 DNA 洗脱液 2.0 来洗脱。
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