DNA去磷酸化试剂盒
产品及特点 分子克隆时,载体的自连极大降低了连接效率,如果对载体 DNA 两个 5′端的-PO4 基团进行去磷酸化处理,则可以抑制自连反应。此外在进行 DNA 5′端标记前,也需要将其本来的-PO4 基团去除以便加上标记基团。本公司开发的 DNA 去磷酸化产品就是针对这一目的而开发。它具有下列特点:
1. 把 DNA 5′端的-PO4 基团变成-OH 基团,使其丧失连接能力。
2. 模板可以是单链 DNA,也可以是双链 DNA,既可以是平末端,也可以是 5′端突出或 3′端突出的粘性末端。
3. 处理后的核酸纯化后可以直接用于连接反应和标记反应。
4. 本产品足够 20 次 20μL 体系的去磷酸化实验
5. 本产品仅供科研使用。
DNA去磷酸化试剂盒
规格及成分成 份 编 号 塑料袋包装
10×去磷酸缓冲液 130828a 50 μL(紫盖)
碱性磷酸酶 130828b 10 μL(红盖)
超纯水 100935 1 mL(蓝盖)
使用手册 130828sc 1 份
DNA去磷酸化试剂盒运输及保存 低温运输,-20℃保存,有效期为 12 个月。
自备试剂 DNA 片段
使用方法 注意:dNTP 和 ATP 也是碱性磷酸酶的底物,所以如果 DNA 溶液中有 dNTP(比如 PCR 产物中)和 ATP,一定要先将其去除,否则它们会耗掉大量的碱性磷酸酶活性,降低 DNA 去磷酸化效率。
一、纯化 DNA 片段的去磷酸化
1、在微量离心管中配制下列反应液(20μL):
成 分 用 量
胶回收的 DNA 片段 1 pmol(相当于 1ug 3Kb 的线状质粒)
10×去磷酸缓冲液 2 μL
碱性磷酸酶 0.5 μL
超纯水到 20 μL
2、建议在 37℃反应 30 分钟(对平末端、5′端突出或 3′端突出的 DNA 片段均采用此保温条件)。
3、65℃反应 5 分钟变性碱性磷酸酶。
4、DNA 片段可以直接用于连接。
二、限制性酶切反应的同步去磷酸化
5、本碱性磷酸酶在几乎所有限制性内切酶的缓冲液中都有活性,所以可以按 1ug3Kb DNA 加 1μL 碱性磷酸酶的比例直接加到限制内切酶的反应液中(反应液中不能含 dNTP 和 ATP)。
6、加热灭活限制性内切酶和碱性磷酸酶(灭活条件根据限制性内切酶不同而不同,但不能低于 65℃,时间不能短于 5 分钟,否则不能灭活碱性磷酸酶)。灭活后的样品可以直接用于后续实验。
7、如果不能采取加热灭活限制性内切酶和碱性磷酸酶,则需酚/氯仿抽提去除酶。具体操作如下(本试剂盒不提供相关试剂,需要从本公司另购相关试剂,下列操作仅供参考):
附:酚/氯仿抽提去除酶步骤:
1、在反应液中加入超纯水使体积变成 100μL,以免纯化过程中 DNA 丢失。如果有必须,可以加入和 4μL 核酸助沉剂提高回收效率。
2、加入 100μL 酚/氯仿/异戊醇 25:24:1 混合液震荡半分钟混匀,室温 12000g离心 3 分钟,转移上清到新离心管中。
3、加 0.1 倍体积(即 10μL)的 3 M 乙酸钠溶液(pH 5.2)。
4、再加入 2.5 倍体积(即 250μL)的无水乙醇。
5、混匀后 12000g 4℃离心 10 分钟,小心弃上清。
6、加入 1mL 70%乙醇,短暂离心 3 分钟后小心弃上清。
7、短暂离心 5 秒,吸弃残留液体(约 30-50μL)。
8、室温放置 2 分钟干燥后加入适量的超纯水溶解 DNA,立即使用或放-20℃长期保存。
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