动物RNAout(TRIzol)
产品及特点
本产品是类似于 基于异硫氰酸胍/酚/氯仿提取原理的快速总 RNA 提取试剂,可用于从各种动物组织(包括白细胞)和部分植物材料中 快速提取总 RNA。
1. 操作简单快速,只要 10 分钟左右,可以全在室温下进行。
2. RNA 质量高,OD260/OD280 一般在 1.9 左右。一般不含用 RT-PCR 可以检测到的基因组 DNA 污染。
3. 适用于大部分实验材料,如培养细胞、各种动物材料和少数植物材料。 植物 RNA 的提取好使用天泽基因的植物 RNAOUT。
4. 性价比高于进口 和 TRI Reagent 等同类产品。
规格及成分 成 份 编 号 小立盒包装
动物 RNAout LM3070a 100 mL(广口棕色玻璃瓶 使用手册 LM3070sc 1 份
运输及保存 常温运输,4℃保存,有效期一年。
自备试剂 氯仿、异丙醇、75%乙醇、RNase-free 水。
使用方法
注意:下面的操作步骤是用 1 mL 本产品进行的微量提取的,细胞使用量一 定要准确,不能超过下述用量,否则将超出本产品的裂解能力,RNA 产量 将急剧降低。如果样品量大,请按比例增加各成份的用量。RNA 工作环境 好用高效无毒的固相 RNase 清除剂(CAT#:3080)彻底处理。
1. 对贴壁细胞(10 平方厘米):吸尽培养液,加入 1 mL 的本产品用枪充 分吹打确保细胞全部裂解,然后将裂解液转移至干净的 1.5 mL 塑料离 心管中,进入第 6 步。
2. 对悬浮细胞(五百万至一千万个):离心收集细胞,吸尽液体,加入 1 mL 本产品,用枪充分吹打确保细胞全部裂解,然后将裂解液转移到干净的 1.5 mL 塑料离心管中,进入第 6 步。
3. 对新鲜组织(50-100 mg):将新鲜组织剪切成小块,放入 10 mL 或 15 mL 塑料离心管中,加入 1 mL 的本产品,用 Polytron 剪切式匀浆 器冰上匀浆 30 秒左右,将匀浆液转移至新的 1.5 mL 塑料离心管中, 进入第 6 步。注意:对肝、脾、胰、肾等细胞分裂十分旺盛的组织(细 胞中含大量正在复制的 DNA),使用量不要超过 30-50 mg,否则十分 容易产生 DNA 污染。对 10 mg 以下的组织,好加入本公司的微量 RNA 助沉剂。
4. 对 RNALOCKER保存的组织(50-100 mg):先用纸吸去 RNALOCKER液 体后再剪切成小块,其余操作同第 3 步。RNALOCKER 处理后的组织韧 性很强,匀浆时间需要适当延长。
5. 对液氮中保存的组织(50-100 mg):在研钵中研磨成粉,加入 1 mL 本产品,用枪充分吹打确保细胞全部裂解,然后将裂解液转移到干净的 1.5 mL 塑料离心管中,进入第 6 步。
6. 在装有裂解物/匀浆物的 1.5 mL 塑料离心管中加入 0.2 mL 自备氯仿, 振荡器上充分振荡混均 30 秒。注意:一定要把官底的溶液震荡起来, 否则只是液面的振动。
7. 13000-15000 g 室温离心 3 分钟。
8. 将上清液(约 0.6 mL)转移到另一干净的 1.5 mL 塑料离心管中。下 层有机相(蓝色)和中间层含有 DNA 和蛋白质,避免触及,否则将产 生蛋白质和 DNA 污染。为保险起见,可以留下 50-100uL 上清液不取。
9. 对脂类丰富的组织(如脂肪组织和脑组织),需再重复氯仿抽提一到两 次以让氯仿充分去除脂类分子。
10. 在上清液中加入等体积的异丙醇,振荡器上振荡 30 秒混匀。
11. 13000-15000 g 室温离心 5 分钟,离心底的侧面将形成 RNA 沉淀。 如果组织使用量低于 10 mg 或需要提高 RNA 回收率,可以将离心时 间延长到 20 或 30 分钟。
12. 小心吸弃上清液,注意不要吸弃 RNA 沉淀。
13. 在含 RNA 沉淀的离心管中加入 1mL 75%乙醇,振荡混匀 30 秒。
14. 13000-15000 g 室温离心 1 分钟。
15. 小心吸弃上清液,注意不要吸弃 RNA 沉淀。
16. 重复第 13-15 的洗涤步骤一次(也可以省略)。
17. 短暂快速离心,用移液枪小心吸弃残留乙醇(约 50 uL)。注意不要吸弃 RNA 沉淀。此步十分重要,否则残留的乙醇会影响 RNA 的后续使用。
18. 室温放 1-2 分钟后立即加入 50-100 uL RNase-free 水使 RNA 沉淀溶 解。千万不要用真空离心法使 RNA 沉淀过于干燥,否则 RNA 将变得 十分难溶。RNA 样品可以立即使用或存放于-80℃待用。 注意:由于 RNase-free 水没有主动灭活残留 RNase 的功能,而任何 方法提取的 RNA 都可能有残留的 RNase,所以强烈建议客户使用本公 司推出的具有主动灭活残留 RNase 功能的、同时跟后续 RT-PCR 等反 应兼容的液相 RNase 清除剂(CAT#:3091)。
附一:RNA 完整性的电泳检测(仅供参考,本产品不含相关试剂) 如果需要做 Northern 杂交,强烈建议用户使用甲醛变性胶进行 RNA 电泳,因为非变性胶不能分离所有的 RNA 分子(BioTechniques,28: 414,2000)。如果是简单检测,可以使用 TAE 缓冲液或超快核酸电泳液 进 行 常 规电 泳 ,但 文献 报 道 必须 使用 RNAon 这 样 的变 性 上样 液 (BioTechniques,9:558,1990)。普通 DNA 上样液不含变性剂,也 没经过去 RNase 处理,所以好不要使用,否则 RNA 容易降解。 动物 RNA 电泳后应该在 UV 下呈现三条清晰的 rRNA 带,28S rRNA 条 带的荧光强度一般比 18S rRNA 条带的荧光强度强 1.5-2.3 倍。如果这两 条 rRNA 带不清晰或比例小于此范围则表示 RNA 有降解(因为大的 RNA 被酶降解的可能更大)。
跟动物一样,植物果实和种子的 RNA 一般有三条电泳带,但植物叶片 的 RNA 有四条或更多 rRNA 带,多余的 RNA 来源于叶绿体。
如果电泳发现 RNA 样品中有 DNA 污染(一般是使用过多样品造成), 可分别用天泽基因的非酶 DNA 清除剂或 RNase-free DNase 清除。
附二:RNA 产量和纯度测定(仅供参考,本产品不含相关试剂)
用 pH 在 7.5-8.2 的 TE 缓冲液将 5-10 μL RNA 稀释 10-20 倍后在 OD260 和 OD260 测光吸收,通过光吸收可以得出 RNA 浓度(1 OD260 的 RNA=40 μg/mL),进而计算出 RNA 的产量(浓度×体积)和产率(RNA 产量/组织用量)。RNA 的产率还随组织的营养状态和组织的种类不同而不 同,一般来说,代谢旺盛的组织(如肝脏和肾脏)RNA 的产率高,代谢不旺盛 的组织(如肌肉和脂肪组织)RNA 的产率低,下面是常见动物组织 RNA 产率: 肌肉,胎盘和脑组织:1-2 μg RNA/mg 组织 肝,胰和肾组织: 5-10 μg RNA/mg 组织 培养细胞: 5-15 μg/10E6 细胞 RNA 的纯度通过 OD260/OD280 来确定,一般在 1.8-2.1 之间即算 合格。但即使低于此范围,一般也不会影响 RT-PCR 等反应。
蛋白质污染可以通过酚/氯仿抽提一次然后酒精沉淀去除,多糖污染可 以用天泽基因的多糖清除剂去除。 关联产品 RNADOWN、、液相 RNase 清除剂、固相 RNase
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