DNA5’末端标记试剂盒

DNA5’末端标记试剂盒

产品及特点本产品为 DNA 5’末端标记系统，利用 T4 Polynucleotide Kinase（T4 多聚核苷酸激酶）和［γ-32P］ATP 对粘性末端或平末端的 DNA 或 RNA 的 5’ 末端进行高效标记反应。原理如下： 本产品具有下列特点：

1. 使用本试剂盒之前，不需要对 5’末端的磷酸基团进行去磷酸化处理，因 为使用的 kinase 能使 5’末端的磷酸与[γ-32P]ATP 的γ-磷酸进行交换。

2. 合成的单链或双寡核苷酸的 5’末端游离的 OH 基团都能通过 Kinase 反 应被标记（或者只是简单的磷酸化）。

3. 提供的两种反应液使交换反应和磷酸化反应都能高效进行，均能得到大于 106 cpm/pmol（5’-end）的比活性。
规格及成分 成份 编号 热封袋包装 
T4 多聚核苷酸激酶（10 U/μL） 131036A 20 μL
5×交换反应缓冲液 131036B 100 μL
10×磷酸缓冲液 131036C 50 μL
Control DNA 131036D 20 μL
使用手册 1 份

运输及保存 低温运输，-20℃保存，有效期一年。

自备试剂 DNA 片段、［γ-32P］ATP 或其它的标记、未标记的 ATPs、牛小肠碱性磷酸 酶（CIAP）等

使用方法 一、交换反应 1. 实验前需自备的试剂：7 M 醋酸铵、100%乙醇、70%乙醇等 2. 在微量离心管中制备下列反应液： 成分 加入的体积 自备的 5’磷酸化 DNA 片段 14 μL(≤5 pmoles 的 5′末端) 5×交换反应缓冲液 5 μL [γ -32P] ATP 5 μL T4 多聚核苷酸激酶（10 U/μL） 1 μL 灭菌的超纯水 补足到 25 μL 注：5 pmoles 的 5’末端约等于 0.17 μg 的长 100 bp 的双链 DNA。 3. 37℃反应 30 分钟。 4. 70℃加热 5～10 分钟使酶失活。 5. 加入 10 μL 的 7 M CH3COONH4（pH 4.5）。如使用 CH3COONa 做 乙醇沉淀时使其终浓度达 300 mM。 6. 加入 87.5 μL（2.5 倍）的冷无水乙醇，-20℃放置 30～60 分钟。 7. 离心回收沉淀，用 70%的冷乙醇清洗沉淀，真空干燥。

8. 用适当 Buffer 溶解沉淀。 注：通过第 5～8 步操作几乎可以除去大部分未反应的[γ-32P] ATP，如要 完全将其除去时，乙醇沉淀后用凝胶过滤等方法精制即可。如需用苯酚抽 提除去蛋白质时，请在第 8 步之后进行。

二、磷酸化反应标记 A. 去磷酸化反应 1. 实验前需自备的试剂：TE 饱和酚/氯仿、

3 M NaCl 、100%乙醇、70% 乙醇、牛小肠碱性磷酸酶（CIAP）等 2. 在微量离心管中制备下列反应液： 成分 加入的体积 自备的 DNA 片段 133 μL(≤10 μg) 1 M Tris-HCl，pH 8.0 15 μL 牛小肠碱性磷酸酶 （CIAP，10~20 U/μL） 2 μL 灭菌的超纯水 补足到 150 μL 3. 50℃反应 30 分钟。

4. 加入 150 μL 的 TE 饱和酚/氯仿/异戊醇（25：24：1），充分混匀。

5. 离心，取上层（水层）移到另一个微量离心管中。

6. 重复操作 4～5。

7. 加入 7.5 μL 的 3 M NaCl（最终浓度 150 mM）。

8. 加入 375 μL（2.5 倍量）的冷无水乙醇，-20℃放置 30～60 分钟。

9. 离心回收沉淀，用 1 mL 70%的冷乙醇清洗后，沉淀真空干燥。

10. 使用 20 μL 的 TE Buffer 溶解沉淀。