一站式MBP标签蛋白纯化套装
产品及特点MBP(麦芽糖结合蛋白,Maltose Binding Protein)标签蛋白大小为 40kDa,由大肠杆菌 K12 的 malE 基因编码。MBP 可增加在细菌中过量表达的融合蛋白的溶解性,尤其是真核蛋白。如果蛋白在细菌中表达,MBP 可以融合在蛋白的 N 端或 C 端。MBP 融合蛋白可通过交联淀粉亲和层析一步纯化,结合的融合蛋白可用 10 mM 麦芽糖在生理缓冲液中进行洗脱。如果要去除 MBP 融合部分,可用位点特异性蛋白酶切除。可用 MBP 抗体或表达的目的蛋白特异性抗体检测 MBP 标签标记的重组蛋白。由于 MBP 融合蛋白原核表达载体具有表达效率高,易于纯化等优点。在现代分子克隆中 MBP 常作为融合蛋白被广泛应用。本产品就是专门用于分离纯化 MBP 融合蛋白的试剂盒,它具有下列特点:
1. 一站式套装,含所需的直链淀粉和琼脂糖介质、溶液和层析柱,操作非常方便。
2. 提供 2 mL 直链淀粉-琼脂糖介质,其载量为 10 mg MBP 蛋白/mL介质。
3. 采用麦芽糖温和洗脱,无去污剂和变性剂对蛋白活性的影响。
4. 本试剂盒足够 20 次制备,但介质可以反复使用更多次(需要复活)。
一站式MBP标签蛋白纯化套装
规格及成分 成份 编号 大纸盒包装
直链淀粉-琼脂糖介质 130871A 2 mL
1 M Tris-HC(l pH 7.4) 25-07640 25 mL
0.1 M EDTA 溶液 131181 25 mL
2 M NaCl 溶液 25-06280 50 mL
蔗糖 57-50-1 20 g
PMSF(10 mg/mL) 100833 1 mL
0.1 mM MgCl2溶液 130871B 50 mL
0.1 M 麦芽糖溶液 130871C 25 mL
层析柱(6 mL) 110809 1 支
使用手册 130871sc 1 份
一站式MBP标签蛋白纯化套装运输及保存 常温运输和保存,但介质需 4℃保存,PMSF 需要-20℃保存,有效期一年。
自备试剂 去离子水、20%乙醇、0.22 μm 或 0.45 μm 滤膜
使用方法 1. 将直链淀粉-琼脂糖介质充分混匀后,取适量加入到预放了一片筛板的层析
柱中(介质用量需要根据 MBP 蛋白产量决定,其载量为 10 mg MBP
蛋白/mL 介质,请根据实验需要取适量的介质加入层析柱中)。
2. 用 5 倍柱体积(柱体积指的是填料介质的体积,下同,本试剂盒介质的体积
是 2mL)自备去离子水洗柱,共 3 次。
3. 用 5 倍柱体积(约 10mL)的新配的结合缓冲液洗柱,进行平衡,使填料介
质处于与目的蛋白相同的缓冲体系下,起到保护蛋白的作用。结合缓冲液的
配方如下(以 10 mL 为例):
成分 用量 在结合缓冲液中的浓度
1 M Tris-HCl(pH 7.4) 0.2 mL 20 mM
0.1 M EDTA 溶液 0.1 mL 1 mM
2 M NaCl 溶液 1 mL 200 mM
自备去离子水 8.7 mL - 4. 4℃ 5000 g 离心 10 分钟收集 20 mL 表达菌液,弃上清,将细胞沉淀(约
100 mg)悬于 2 mL 冰冷的现配的细胞洗涤液中,4℃ 5000 g 离心 15 分
钟收集细胞沉淀后,再次悬于 2 mL 冰冷的细胞洗涤液中。(用不加诱
导物的菌液做对照样。)细胞洗涤液的配方如下(以 10 mL 为例):
成分 用量 在细胞洗涤液中的浓度
1 M Tris-HCl(pH 7.4) 0.1 mL 10 mM
2 M NaCl 溶液 0.15 mL 30 mM
自备去离子水 9.75 mL - 5. 制备细胞裂解物:
1) 如果所用载体不带 MBP 信号肽序列(如 pMAL-c2)
a) 超声破碎细胞,功率 30 W,保持细胞低温(0℃),直到在显微镜
下看见绝大多数细胞破裂。(超声参数需根据仪器型号自行摸索,
但裂解物必须不粘稠,否则会堵塞层析柱。)
b) 为使溶液澄清,向上述细胞洗涤液中加入 35 uL PMSF(10
mg/mL)。
c) 4℃下 13000-15000 g 离心 30 分钟,以去除残留细胞和细胞碎片
以防堵柱,收集上清样品,留样做 SDS-PAGE 电泳对照,其余样
品用于纯化 MBP 融合蛋白,直接进入第 6 步。
2) 如果所用载体带 MBP 信号肽序列(如 pMAL-p2)
a) 4℃ 5000 g 离心 15 分钟收集细胞,沉淀悬于 1 mL 冰冷的现配
的细胞裂解液中。细胞裂解液的配方如下(以 10 mL 为例):
成分 用量 在细胞裂解液中的浓度
1 M Tris-HCl(pH 7.4) 0.3 mL 30 mM
0.1 M EDTA 溶液 0.01 mL 0.1 mM
蔗糖 2 g 20%(m/V)
自备去离子水 加水到 10 mL - b) 加入 25 uL PMSF(10 mg/mL),室温搅动 15 分钟,于 4℃
13000-15000 g 离心 10 分钟收集细胞。
c) 旋动细胞沉淀,加入 2 mL 冰冷的 0.1 mM MgCl2溶液,4℃搅动
10 分钟。
d) 休克细胞 4℃ 13000-15000 g 离心 10 分钟,在上清中加入 10
mM Tris-HCl(pH 7.4)(可将 1 M Tris-HCl,pH 7.4 稀释 100
倍配制而成)至 pH 为 7.4。
e) 上清用 0.22 μm 或 0.45 μm 滤膜过滤,滤液用 100 倍体积的
10 mM Tris-HCl(pH 7.4)(配方如上)4℃透析。
f) 收集透析后样品,留样做 SDS-PAGE 电泳对照,其余样品用于纯
化 MBP 融合蛋白,直接进入第 6 步。
6. 将样品加到平衡好的直链淀粉-琼脂糖介质中(保证目的蛋白与介质充分接
触,以提高目的蛋白的回收率),收集流出液。
7. 用 10-15 倍柱体积的结合缓冲液(配方见上表)进行清洗,去除非特异性
吸附的杂蛋白,收集洗杂液。
8. 使用 5-10 倍柱体积的现配的麦芽糖洗脱液洗脱结合的融合蛋白,收集洗脱
液(即目的蛋白组分)。麦芽糖洗脱液的配方如下(以 10 mL 为例):
成分 用量 在麦芽糖洗脱液中的浓度
1 M Tris-HCl(pH 7.4) 0.2 mL 20 mM
0.1 M EDTA 溶液 0.1 mL 1 mM
0.1 M 麦芽糖溶液 1 mL 10 mM
自备去离子水 8.7 mL - 9. 将纯化得到的样品(包括流出液、洗杂液和洗脱液)以及原始样品使用
SDS-PAGE 检测纯化效果。
10. 填料介质清洗:依次使用 3 倍柱体积的结合缓冲液和 5 倍柱体积的去离子
水平衡介质,最后再用 5 倍柱体积的 20%的乙醇平衡,然后保存在等体积
的 20%的乙醇中,置于 4℃保存,防止填料被细菌污染。本介质可重复使
用。 蛋白酶切割释放靶蛋白(可选步骤,所用试剂需自备)
11. 用适当的蛋白酶切割融合蛋白释放靶蛋白。
1) 加入自备的凝血酶、肠激酶或 Xa 因子(根据融合蛋白中的位点选择)。
每毫升介质中加入 50 单位的溶于 1 mL PBS 溶液的蛋白酶。颠倒离心
管数次混匀,室温下振荡 2-16 小时。
2) 4℃以 500 g 离心 5 分钟,上清小心转移到新离心管中。
3) 用传统的层析方法或 SDS-PAGE 电泳分离靶蛋白和蛋白酶。
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