酿酒酵母EGY48化学感受态细胞

酿酒酵母EGY48化学感受态细胞

EGY48 菌株是 LexA 系统酵母双杂实验用菌株，MATa 型，可直接转化质粒进行蛋白 互作验证或筛库试验；Transformation marker 为: his3, trp1, ura3，报告基因为： LEU2；报告基因 UAS（上游激活序列）来源于 LexA op(x6)，只有当 Bait 和 Prey 互作 时才能启动 LEU2 表达。EGY48-LexA 酵母双杂系统需要三种质粒配套使用：pLexA、 pB42AD、p8op-LacZ。质粒 pLexA 的筛选标志为 HIS3，用于表达 DNA-BD(来自原核 的 202 个氨基酸残基组成的 LexA 蛋白)与目标蛋白(Bait)的融合蛋白；质粒 pB42AD 的筛 选标志为 TRP1，用于表达 AD(来自疱疹病毒的 88 个氨基酸残基组成的 B42AD 蛋白)与目 标蛋白（Prey）的融合蛋白；报告质粒 p8op-LacZ 的筛选标志为 URA3，报告基因为 LacZ， 报告基因 UAS 来源于 LexA op(x8)，只有当 Bait 和 Prey 互作时才能启动 LacZ 表达。 EGY48感受态细胞是实验室常用酵母双杂用菌株，

本产品经特殊工艺制作而成，经 PGBKT7质粒检测转化效率为104 cfu/μg DNA。

菌株基因型如下： MATα,ura3, his3, trp1, LexAop(x6)-LEU2
规格及成分 成分 编号 包装
EGY48 感受态细胞 140387A 0.1 mL×10
Carrier DNA，5 μg/μL 140387B 100 μL
PEG/liAC 140387C 5 mL
使用手册 1 份

运输及保存 感受态细胞干冰运输、-80℃保存，Carrier DNA -20℃保存；PEG/liAC 4℃保存；有效 期半年。

自备试剂 目的 DNA、YPDA、 SD 培养基等

使用方法

1. 取感受态细胞置于冰浴中。一次转化感受态细胞的建议用量为 50-100μL，可以根据 实际情况分装使用。 以下实验以 100 μL 感受态细胞为例。

2. 待感受态细胞融化后，向感受态细胞悬液中依次加入预冷的目的质粒 2-5μg，Carrier DNA（95-100℃ 5 分钟，快速冰浴，重复一次）10μL，PEG/LiAc 500μL，吹 打混匀，30℃水浴 30 分钟（15 分钟时翻转 6-8 次混匀）。

3. 42℃水浴 15 分钟（7.5 分钟时翻转 6-8 次混匀）。

4. 5000 rpm 离心 40 秒， 弃上清。取 400μL ddH2O 重悬沉淀，5000rpm 离心 30 秒，弃上清。

5. 取 50μL ddH2O 重悬沉淀，涂板，29℃培养 48-96 小时。

注意：

1. EGY48 酵母菌株对高温敏感，最适生长温度为 27-30℃；高于 31℃，生长速度和转 化效率呈指数下降。

2. 酵母在缺陷培养基中生长速度比 YPDA 培养基慢，培养基中缺陷成分越多，生长越慢， 以转化涂板为例：涂 YPDA 平板 29℃，48h 培养可见直径 1mm 克隆；涂 SD 单缺平 板 29℃，48-60h 培养可见直径 1mm 克隆，涂 SD 双缺平板 29℃，60-80h 培养可 见直径 1mm 克隆，涂 SD 三缺或四缺平板 29℃，80-90h 培养可见直径 1mm 克隆。

3. 转化高浓度的质粒可相应减少最终用于涂板的菌量。

4. 同时转化 2-3 种质粒时可增加质粒的用量。