人基因开放阅读框(ORF)库制备

信裕生物的人基因开放阅读框(ORF)库(Human Open Reading Frame library)包含约15,000个人基因ORF克隆，其中包括已知的基因约12,000种。本人基因ORF库的每一种质粒都来自于单克隆，并且每一个ORF都经过了测序验证。后续使用Gateway系统或PCR反应即可非常方便地克隆目的基因到新的表达载体中。
      本人基因ORF库的克隆在供体载体(Donor vector) pDONR223中，其图谱如图1所示。

图1. pDONR223质粒图谱。 pDONR223的全序列信息：pDONR223-seq.txt。

      ORF克隆是指起始密码子和终止密码子之间的编码序列，而不包含mRNA的5’和3’端的非编码区(untranslated region, UTR)。本ORF库是通过mRNA反转录获得的编码蛋白质的cDNA，再通过Gateway技术的BP重组反应克隆到pDONR223载体中得到入门载体，其重组位点的序列如图2所示。为了便于后续利用Gateway系统添加适当的3’标签，所有的克隆都无终止密码子。在信裕生物的人基因ORF库中，每一个克隆都代表一个独立的插入序列，随机挑取克隆测序，准确率为95%，但较长基因克隆准确率略差。

图2. ORF两侧的重组序列

      信裕生物的人基因ORF库提供的是含有相应ORF质粒的大肠杆菌甘油菌(DH5α)，本产品一套共169 块96孔板。克隆载体为
pDONR223，载体抗性spectinomycin，推荐使用终浓度为50μg/ml。正向测序M13F引物序列为GTAAAACGACGGCCAGT，反向测序T7引物序列为TAATACGACTCACTATAGG。
      人基因开放阅读框(ORF)库基因清单请点击下载。
包装清单：

保存条件：
      -20℃保存，二年有效。-80℃保存，五年有效。
注意事项：
      pDONR223载体不能直接在细菌或哺乳动物细胞中表达相应蛋白，需要重新克隆至相应表达载体才能表达。
      本产品仅限于专业人员的科学研究用，不得用于临床诊断或治疗，不得用于食品或药品，不得存放于普通住宅内。
      为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。使用说明：
1. 根据所需人基因ORF的名称，查询并选取相应的96孔板及孔进行菌种的接种培养。
a. 划平板随后挑取单克隆培养：取出对应的96孔板置于冰上，并在超净台内进行后续操作。等菌液稍融化，撕开封口膜，并小心揭开96孔板板盖，注意不要交叉污染。按照如下方法之一划平板接种，随后挑取单克隆接种到含抗生素的LB中培养。
(a) 用镊子和塑料枪头操作：镊子的顶端在70%酒精中蘸一下，并且在酒精灯上略略烧一下，使镊子的顶端处于无菌状态。用镊子夹取一个无菌的200微升塑料枪头，蘸取少量DH5α甘油菌，然后把蘸有菌液的塑料枪头，以尽量和LB平板接近平行的角度，在含50μg/ml spectin omycin的LB平板上连续作S形或Z形划动，再用一无菌的200微升塑料枪头，在原先的划线上以90或120度角，再在LB平板上连续作S形或Z形划动。通常换枪头重复操作2-3次即可。37℃倒置培养过夜。
(b) 用接种环操作：将接种环在酒精灯上略略烧一下，使接种环处于无菌状态。微冷后，蘸取少量DH5α甘油菌，在含50μg/ml spectinomycin LB平板上连续作S形或Z形划动。把接种环再烧一下，微冷后，在原先的划线上以90或120度角，再在LB平板上连续作S形或Z形划动。通常用接种环重复操作2-3次即可。37℃倒置培养过夜。
b. 直接培养：取出对应的96孔板置于冰上，并置于超净台内，后续操作都在超净台内操作。把镊子的顶端在70%酒精中蘸一下，并且在酒精灯上略略烧一下，使镊子的顶端处于无菌状态。用镊子夹取一个无菌的塑料枪头或牙签，蘸取少量DH5α甘油菌，然后把蘸有菌液的塑料枪头或牙签放到装有3毫升含50μg/ml spectinomycin 的LB细菌培养试管内或装有100毫升或更大体积LB的细菌培养瓶内。37℃，约200rpm培养过夜。
2. 对于培养的菌液进行质粒的小量、中量或大量抽提。
3. 重组或PCR克隆：人基因ORF库的每一个蛋白质编码序列两端有特异的重组序列。通过LR重组反应可以将ORF转移到特定接收载体中，例如Gateway系统的pDEST系列载体等，从而使目的基因在大肠杆菌、酵母、昆虫细胞或哺乳细胞等中表达；也可以此ORF库作为模板用PCR或其它常规方法克隆到其它蛋白表达载体中用于在细菌、酵母、昆虫细胞或哺乳动物细胞等中的表达