Annexin V-PE/7-AAD双染细胞凋亡检测试剂盒

Annexin V-PE/7-AAD双染细胞凋亡检测试剂盒

中文名称：Annexin V-PE/7-AAD双染细胞凋亡检测试剂盒

英文名称：Annexin V-PE/7-AAD Apoptosis Detection Kit

产品规格：10T|20T|50T|100T

本试剂盒可应用于培养细胞凋亡检测（不推荐用于检测组织样本）。

在正常细胞中，磷脂酰丝氨酸（PS）只分布在细胞膜脂质双层的内侧，而在细胞凋亡早期，细胞膜中的磷脂酰丝氨酸（PS）由脂膜内侧翻向外侧。Annexin V是一种分子量为35～36kD的Ca²⁺依赖性磷脂结合蛋白，与磷脂酰丝氨酸有高度亲和力，故可通过细胞外侧暴露的磷脂酰丝氨酸与凋亡早期细胞的胞膜结合。因此Annexin V被作为检测细胞早期凋亡的灵敏指标之一。将Annexin V进行荧光素PE标记，以标记了的Annexin V作为荧光探针，利用荧光显微镜或流式细胞仪可检测细胞凋亡的发生。

7-AAD（7-amino-actinomycin D）是一种核酸染料，它不能通过正常质膜，随着细胞凋亡、细胞死亡过程，质膜对7-AAD的通透性逐渐增加，结合细胞凋亡中DNA的有控降解，在合适波长激发光的激发下可发出明亮的红色荧光，通过7-AAD标记DNA的强弱，将细胞分为三群：7-AAD强为死亡细胞，7-AAD弱是凋亡细胞，7-AAD-为正常活力细胞。7-AAD同PI有着相似的荧光特性，但其发射波谱较PI窄，对其他检测通道的干扰更小，在多色荧光分析中是PI的替代品，可与Annexin V-PE联合使用。

试剂盒组成：
 

保存条件：2～8℃避光，有效期1年。

试剂盒以外自备仪器和试剂
流式细胞仪或荧光显微镜、低速离心机、微量移液器、1.5mL Microtube、载玻片、盖玻片（荧光显微镜观察需用）、PBS、不含EDTA的胰酶消化液

使用注意事项：
1．微量试剂取用前请离心集液。
2．Annexin V-PE/7-AAD避光保存及使用。
3．7-AAD为潜在致癌物，操作时请采取防护措施，穿防护服、戴手套等。
4．本试剂盒适用于检测活细胞，流式细胞仪检测时，细胞数量不以应低于1×10⁵，不推荐用于检测组织样本。
5．推荐使用悬浮培养细胞。如果是贴壁细胞，建议适用不含EDTA的胰酶消化，如消化不当，可能引起假阳性，而用细胞刮子会造成细胞粘连成团，而影响检测。可将胰酶消化后细胞的保存在含2%BSA的PBS中，防止进一步的损伤。
6．细胞固定后可能导致荧光的淬灭，请不要固定样品。
7．因检测细胞的类型、凋亡诱导剂种类、使用的检测仪器不同，因而流式检测的荧光补偿也不同，因此建议每次检测均需使用未经凋亡诱导处理的细胞作为对照，进行荧光补偿的调节。

操作方法：

1．悬浮细胞离心（2000rpm离心5min）收集；贴壁细胞用不含EDTA的胰酶消化收集；
  注：胰酶消化时间不易过长，否则容易引起假阳性。
2．用PBS洗涤细胞二次（2000rpm离心5min）收集1~5×10⁵细胞；
3．在50μL的Binding Buffer中加入5μL 7-AAD染液，混匀；
4．收集细胞中加入上述7-AAD染液，混匀；室温、避光、反应5～15min；
5．反应后再加入450μL的Binding Buffer混匀；
6．加入1μL Annexin V-PE混匀；室温、避光、反应5～15min；
7．请在1小时内，进行下述荧光显微镜或流式细胞仪的观察和检测。

A．荧光显微镜观察
1．滴一滴上述染色后的细胞悬液于载玻片上，并用盖玻片盖上细胞；
2．对于贴壁细胞来说，也可直接用盖玻片来培养细胞并诱导细胞凋亡；
① 将细胞于盖玻片上生长，用适当的凋亡诱导剂诱导细胞凋亡，并设立阴性对照组；
② 用PBS洗涤细胞两次；
③ 在500μL的Binding Buffer中加入1μL Annexin V-PE，5μL 7-AAD染液混匀；
④ 将上述溶液滴加于盖玻片表面，使长有细胞的盖玻片表面均匀覆盖；
⑤ 避光、室温反应5min。
3．将盖玻片倒置于载玻片上，于荧光显微镜下滤光片（罗丹明）观察Annexin V-PE荧光信号呈橙红色；激发波长546nm，发射波长647nm，观察7-AAD荧光信号呈红色。

B．流式细胞仪分析
1．用流式细胞仪检测，激发波长Ex=488nm;发射波长Em=578nm，Annexin V-PE的橙红色荧光建议使用FL2通道检测；激发波长Ex=546nm;发射波长Em=647nm，7-AAD红色荧光建议使用FL3通道检测。
2．荧光补偿调节：使用经凋亡诱导处理的正常细胞，作为对照进行荧光补偿调节去除光谱重叠和设定十字门的位置。

特别提示：本公司的所有产品仅可用于科研实验，严禁用于临床医疗及其他非科研用途！