雷公藤为卫矛科雷公藤属植物雷公藤 Tripterygium wilfordii Hook．f．的干燥根，是一 种公认的同时具有较强药效和较强毒性的中药 材．也是一种对难治性疾病具有突出且疗效稳定 的少有中药之一，广泛用于治疗类风湿性关节 炎、肾病综合征、系统性红斑狼疮等疾病。但其 毒性较大，不良反应高发，严重程度通常是患者 不能耐受的，严重影响其临床应用。雷公藤的主 要有效成分为二萜类、三萜类和生物碱类，研究 表明各种成分均具有不同程度的抗炎、抗肿瘤和 免疫抑制等活性，而雷公藤中生物碱毒性要药效 二萜和三萜类成分，同时临床应用具有疗效好且 不良反应较小的特点。雷公藤次碱是雷公藤生物 碱中含量较高的一种倍半萜类单体化合物。本实 验主要通过建立脂多糖(I。PS)诱导的 RAW264．7细胞炎症模型，探讨雷公藤次碱对 LPS诱导的炎性因子TNF一0：和IL一6释放的影 响，以免疫印迹法(Western Blot)考察雷公藤 次碱对连接蛋白TLR4、MyD88、p38、IKBa、 JNK、ERK在I，PS刺激的RAW264．7细胞中的 表达及其磷酸化的影响，以研究其抗炎作用机 制，为促进雷公藤次碱的应用研究提供基础。
一、材料与仪器
仪器：Model 2300型培养箱(美国Shel— I，ab公司)；Model 680型酶联免疫检测仪(BIO —RAD公司)；温控摇床(New Brunswich， USA)；电泳仪DYY一6C型(北京市六一仪器 厂)；蛋白质垂直电泳仪(北京百晶生物技术有 限公司)；半干转电转槽(北京市六一仪器厂)； 恒温水槽DKB一501A型(上海精宏设备有限公 司)；X射线摄影暗盒(江苏海门凯顺医疗器械 有限公司)；凝胶成像系统(上海培清科技有限 公司)；荧光酶标仪(上海闪谱生物科技有限公司)。
试剂：CCK一8试剂盒(规格：500次／瓶， 上海翊圣生物科技有限公司)；小鼠TNF—a试 剂盒、小鼠IL一6试剂盒(上海西塘生物技术有 限公司，规格：96T)；脂多糖(LPS，美国Sig— ma公司，批号L一2880)；吐温一80(国药集团 化学试剂有限公司，分析纯)；胰酶(美国Difco 公司)；DMEM培养基、胎牛血清(美国Gibco 公司)j TMB底物溶液(上海恒远生物科技有限公司)；Dihydroethidium(南京恩晶生物科技有 限公司)；DCFH—DA探针(上海Sigma公司)； 蛋白酶／磷酸酶抑制剂混合物(vazyme，E312— 01)；RIPA(动物细胞总蛋白抽提试剂) (碧云 天生物技术研究所，P0013B)；BCA Protein Quantification Kit(vazyme，E112—01)；增强 型ECI。化学发光检测试剂盒(即用型) (vazyme，E411)；丽春红染色试剂(碧云天生物 技术研究所，P0022)；PVDF膜(0．45um) (Millipore，IPVH00010)；预染蛋白Marker (10～11 7KD) (Thermo。26616)；封闭液(脱 脂奶粉，pH7．5) (BD，232100)；抗体稀释液 (碧云天生物技术研究所，C1230)；PBS—T (pH8．0，10 x) (碧云天生物技术研究所， B1009)；10×电转移缓冲液(碧云天生物技术研 究所，B1006)；10×电泳缓冲液(碧云天生物技 术研究所，B1005)；SDS—PAGE上样缓冲液 (还原，5×)(碧云天生物技术研究所，B1007)； 显影粉定影粉(天津市世纪奥博商贸有限公司)； X胶片(日本柯达)。
二、方法
(一)雷公藤次碱对RAW264．7细胞增殖的 影响 取对数生长期RAW264．7细胞，胰酶消化， 加入新鲜培养基反复吹打成细胞混悬液，调整细 胞浓度为1×105 cells·mL-1，以每孔100／,I。细 胞悬液接种于96孑L细胞培养板中(空白组加等 量培养基)，置于37。C，5％CO：细胞培养箱中 过夜后取出分组处理。①雷公藤次碱组：每孔加 入lo肚L的样品溶液，使终浓度分别为175、 145、115、85、55肛m01·L；②对照组和③空 白组：加入等量培养基，每组设6个复孔(n一 6)。置于37℃，5％CO。培养箱中培养24h，实 验结束4h前加入10肚L CCK～8试剂，结束后以 酶标仪于450nm处检测吸光度(A)。
(二)雷公藤次碱对LPS刺激的RAW264．7 细胞分泌TNF—a和II。一6的影响 取对数生长期RAW264．7细胞，胰酶消化， 加入新鲜培养基反复吹打，使细胞混悬，调整细 胞浓度为l×10j cells·mL_。，以每孔100ltI．接 种于96孔细胞培养板，置于37℃，5％CO。培 养箱中培养12h后取出分组处理。①雷公藤次碱组：加入终浓度为1”g·mI。_1的LPS溶液于 37℃，5％CO2 培养箱中孵育2h后给予终浓度为 115、57.5、28.8μg·L-1、14．4／1mol·I。_1的雷公藤次碱 溶液；②模型组：加入终浓度为1μg·L-1的 LPS溶液；③对照组和④空白组加入等量培养 基；每组设6个复孔(n一6)。于37℃．5％CO2： 培养箱中培养24h后取出，吸取细胞上清液，采 用EI。ISA试剂盒分别检测上清中TNF～a和1L-6含量。
(三)Western Blot检测雷公藤次碱对 TLR4、MyD88、p—p38、p38、P—JNK、JNK、 p—ERK、ERK和IKBa的影响 取对数生长期RAW264．7细胞，调整细胞 浓度到2.25×105 cells·mL-1 ，以每孔2mL接 种于6孔板，置于37℃，5％CO：培养箱中培养 过夜。分为模型组、对照组、雷公藤次碱处理组 (115、57.5、28.8, tool·I。1)，除空白组外其他 组给予终浓度lttg·mI。l LPS刺激2h后给予相 应药物进行处理。置于培养箱中培养24h后，用 4℃预冷的PBS液洗涤各孑L两次，然后吸弃PBS 液，每孔中加入200／,I。4。C预冷的RIPA提取细胞蛋白，在13000 r·min…下离心20min，弃去 上清，得各样本，Bradford法对蛋白定量。每孑L 加入20t,g蛋白上样，在SDS--PAGE凝胶中电 泳，蛋白转移到PVDF膜上，脱脂牛奶或BSA 封闭，分别用一抗TLR4、MyD88、P—p38、 p38、P—JNK、JNK、P—ERK、ERK、IxBa和 B—Actin过夜，洗2．4。
(四)统计分析与灰度分析
统计学方法实验数据用i±S表示，采用单 因素方差检验法进行统计学处理。应用Alpha软 件处理Western Blot实验所得系统分析目标带的 光密度值，并以各目的8一actin蛋白条带灰度值 与目标条带灰度值的比值作为蛋白相对表达水 平值。 三、结果 由CCK8考察结果可知，雷公藤次碱在浓度 不高于115t,mol·L1时对RAW264．7细胞的增 殖无显著抑制作用，故选择考察115、57．5、 28．8、14．4t,mol·I。1的雷公藤次碱对I。PS刺激 的RAW264．7细胞分泌TNF—a和II。一6的影 响，结果见表1。
讨论和小结
研究发现，LPS诱导后RAW264.7细胞 Toll样受体4(TLR4)的表达明显增高，说明 LPS是或可引导TI，R4的配体与TLR4结合，二 者结合后可启动细胞内一系列信号级联反应，最 终诱导目的基因的表达。TLRs亚型中除TLR3 外，均需要MyD88(Myeloid Different Factory 88，MyD88)来激活下游释放信号分子的通路 这种途径成为MyD88依赖性途径。当TI。R与相 应配体结合后，TLR细胞内的TIR结构，募集 到与TIR有相同结构域的接头分子MyD88，然 后MyD88的死亡结构域(Death Domain，DD) 与IL一1受体相关激酶(IL一1 Receptor--aSSOciated Kinase，IRAK)家族蛋白分子结合，形成细胞信号转导复合物。该复合物可激活下游 TRAF6分子，TRAF6激活丝裂原活化蛋白激酶 (mitogen—activated protein kinase，MAPK)家 族分子。
NF一-kB是一种多效性的转录因子，可被包 括I，PS、氧化应激在内的多种刺激所活化，参与 调控炎症反应、免疫、肿瘤等相关的细胞因子、 趋化因子、黏附分子、炎症介质等的转录过程。 1KB是其抑制蛋白，正常情况下二者结合而使NF一 出处于失活状态，bcBa是1KB的亚分子，它被磷 酸化后NF～kB被释放而恢复活性，从而进人细 胞核，与DNA上的相应位点结合，调控mRNA 的合成而实现相关基因的表达。
研究结果表明，雷公藤次碱可在RAW264.7 细胞炎症通路的多水平上产生抑制作用，最终结 果表现为抑制RAW264．7细胞中炎症因子的释 放。如：雷公藤次碱可显著抑制TI。R4和 MyD88的表达，进而抑制其下游的炎症相关通 路的激活；显著抑制丝裂原活化蛋白激酶家族分 子P38，JNK，ERK的磷酸化，从而阻断 TRAF6信号转导途径；还可显著抑制NF—JcB 抑制蛋白IKB oc的磷酸化，从而调控NF一kB的结 合与释放，最终影响炎症因子的合成。