概述[1][2]
D-荧光素是一种依赖腺苷三磷酸(ATP)生物发光反应的底物，生物发光的原理是荧光素在ATP和氧存在条件下被荧光素酶氧化，其化学反应式如下： ATP+D-Luciferin+O2→Oxyluciferin+AMP+PPi+O2+Light。荧光素/荧光素酶的生物发光反应常用于ATP、能转化为ATP的代谢物(如AMP、ADP、cAMP)和能产生ATP的酶(如肌酸激酶等)的检测，因此生物发光反应可应用于广泛范围内生物材料的检测。近几十年来，ATP 生物发光技术得到了很大的发展，已经在细胞增殖、细胞毒性和生物量计数等方面广泛应用。 在食品卫生领域由于ATP生物发光技术无需培养过程，操作简便、灵敏度高，数分钟内可得 到结果，具有其它微生物检测方法无法比拟的优势，是目前检测微生物最快的方法。除此之外，荧光素酶基因可作为报告基因，在分子生物学上有广泛的应用。因此荧光素/荧光素酶生物发光反应具有很大的市场，D-荧光素作为生物发光反应的底物，随着ATP生物发光反应试剂需求的增加，其需求量越来越大。
制备[1]
1、脱甲基反应
D-荧光素的反应原材料为2-氰基-6-甲氧基苯并噻唑(99％，NEW JERSEY，USA 1-800-ACROS-01)和盐酸吡啶(98％，ACROS ORGANICS)，反应比例为2-氰基-6-甲氧基苯 并噻唑∶盐酸吡啶＝1∶1～3，反应温度为180～250℃，环境为抽真空通氮气，反应时间为0.5～3h。
2、脱甲基目标产物的提取
脱甲基反应后的产物用1∶1～3的乙酸乙酯和冰水洗涤反应后的混合物三次，每次的用量 约为反应原材料的50～100倍。通过萃取有机层后用旋转真空蒸发仪进行浓缩干燥。
3、脱甲基产物的纯化
脱甲基后的目标产物纯化是用80～400目的粗孔硅胶进行柱层析，层析柱用带三通的 可加压式层析纯化柱。用体积比5∶1～3氯仿/乙酸乙酯做洗脱溶剂，对直径为25mm，高为 250mm的层析柱，洗脱流速为1～10ml/min，通过HTLC(高效薄层层析)检测，收集目标产 物浓度的较高部分，合并之后进行旋转真空蒸发浓缩干燥。
4、纯化后的脱甲基产物与D-半胱氨酸的缩合反应
纯化后的脱甲基产物与D-半胱氨酸水合物在碱性混合溶剂中于室温下避光反应 10～30min，用盐酸调pH值至1～6，通过1000～15000r/min室温条件下离心10～20min，收集 沉淀，并将此沉淀在真空条件下干燥，即可得D-荧光素粗品。
应用[2-3]
CN201410013473.5公开一种检测饮用水中卫生质量和GMP工厂表面卫生的ATP生物发光试剂、方法及试剂盒。本发明所述的ATP生物发光试剂，包括荧光素酶、D-荧光素、去ATP无菌处理的发光稳定缓冲系统，所述的荧光素酶必须经过纯化，纯化的荧光素酶的活力本底比达到50~3000，其使得ATP生物发光试剂的发光比活力在0.4mL发光体系中，用1×10-7/L ATP测量时的相对发光对数值达到6.5~7.5，将荧光素酶、D-荧光素、去ATP无菌处理的发光稳定缓冲系统混合后冷冻得到冻干粉。本发明采用高灵敏度稳定发光的ATP生物发光试剂对饮用水卫生质量及GMP工厂表面卫生进行快速检测，在半小时内可以完成取样与快速检测。
CN200610034385.9公开了一种利用ATP生物发光法进行微生物数量快速检测的方法及检测试剂盒，快速检测试剂盒包括荧光素酶及其保护剂、D-荧光素、标准ATP、发光检测缓冲液、非细胞ATP去除剂、微生物细胞ATP抽提剂等试剂。应用该检测试剂盒进行微生物数量快速测定的标准方法是通过在选定的生物发光仪和选定的系统中做ATP标准曲线，取对数后得到线性回归方程，将经过非目的ATP去除和微生物ATP抽提的样品液，在同样的仪器和系统中用同一批酶进行ATP生物发光检测，同时做空白对照，得到样品和空白的CPM或RLU值，去除空白后的净相对发光值取对数后，通过建立的回归方程得到样品的ATP浓度，根据细菌、酵母、霉菌和单细胞微藻等微生物的ATP含量可换算成细菌、酵母、霉菌孢子或单细胞微藻的细胞数，或只计相当于细菌数量。
主要参考资料
[1] CN201110459845.3一种高纯度D-荧光素的制备和纯化方法
[2] CN201410013473.5一种检测饮用水中卫生质量和GMP工厂表面卫生的ATP生物发光试剂、方法及试剂盒
[3] CN200610034385.9生物发光微生物数量抗干扰快速检测试剂盒