背景[1-3]
生物素-标记羊抗鼠免疫球蛋白(H+L)是羊抗鼠免疫球蛋白(H+L)经过生物素标记的荧光标记二抗，许多生物素分子可以与第二抗体偶联，而链霉亲和素的另一优点是对生物素具有高亲和力。通过该扩增步骤并使抗生蛋白链菌素与标记物（例如HRP或荧光探针）结合，更有可能检测到低水平表达的蛋白质。对于大多数测定，首先添加生物素标记的第二抗体，然后依次加入与标记物（例如HRP）偶联的链霉亲和素。
山羊抗小鼠免疫球蛋白抗体是为了能和所有小鼠免疫球蛋白重链和轻链起反应的同类纯化抗体准备的。为了把交叉反应的影响降到最低,相比于其他抗体,山羊抗小鼠免疫球蛋白抗体应优先选择从小鼠免疫球蛋白和血清中提取。标记每个聚合物的标准是每一个免疫球蛋白分子用2-8个荧光团或生物素分子标记。在准备阶段,必须检测样品中有没有非结合的染料,并且把样品在无荧光实验中做检测以确保较低的非特异性染色的可能。
生物素标记的山羊抗小鼠IgG（H+L），使用抗原偶联的琼脂糖微珠从山羊抗血清内亲和色谱纯化所得。免疫电泳和/或ELISA法检测显示本品特异性结合完整的小鼠IgG分子，也会与其他小鼠免疫球蛋白的轻链结合。生物素-标记羊抗鼠免疫球蛋白(H+L)预先与相近物种包括人、牛、马、兔、猪血清蛋白经过亲和吸附处理，ELISA和/或固相免疫吸附检测证实与以上物种几乎无交叉反应。但可能会与其他物种免疫球蛋白发生交叉反应。生物素-标记羊抗鼠免疫球蛋白(H+L)不会识别非免疫球蛋白类的血清蛋白。
应用[4]
用于扫描电化学显微术构建酶图形及全内反射荧光显微术检测鼠IgG
将原子力显微镜中的“蘸笔式”纳米刻饰技术（Dip-Pen nanolithography，DPN）的理念运用到SECM中，用扫描电化学显微术“蘸笔法”构建了辣根过氧化物酶（HRP）微米点。本章中我们首先研究了生物素化的HRP（Bio-HRP）在铂电极上的吸附及脱吸特性，确定了在Bio-HRP铂电极上吸附及脱吸的条件。吸附条件：电极在Bio-HRP溶液中浸泡5次，每次4mir；脱吸时间：60 min。在构建HRP微米点时，先根据Bio-HRP在铂电极上吸附的条件，将Bio-HRP吸附到自制的铂微米电极上，然后将铂电极在合适的电位下即-0.3 V（vs.Ag／AgCl）逼近到链霉亲和素化的基底上方10μm左右，再将Bio-HRP从电极上自然脱吸，通过生物素与亲和素的反应将其固定到基底上得到微米点，并用SECM对其活性进行了表征。同时在工作中为了减小HRP扩散所引起的微米点的扩大，在UME与基底之间形成一厚度为10μm左右的液膜，减小了分子扩散对结果的影响。
用全内反射荧光显微术对鼠IgG在单分子水平上进行了免疫分析。先将盖玻片硅烷化，在盖玻片表面形成环氧基团，然后在盖玻片上加上鼠IgG溶液进行孵育，使鼠IgG分子固定在玻片表面，加上BSA溶液将玻片未固定鼠IgG分子的地方封闭，然后将Alexa488标记的羊抗鼠IgG（H+L）溶液滴加在有鼠IgG溶液的地方进行孵育，这样就在有鼠IgG分子的地方接上了Alexa488标记的羊抗鼠IgG（H+L）分子，孵育完后将多余的Alexa488标记的羊抗鼠IgG（H+L）分子洗掉，用全内反射荧光显微镜检测Alexa488标记的羊抗鼠IgG（H+L）分子，通过检测到的Alexa488标记的羊抗鼠IgG（H+L）分子的个数来确定鼠IgG分子的量。通过去除杂质及降低所使用材料的荧光背景，使用全内反射隐失场激发，减小激发体积，并使用适宜的滤波片，采用高灵敏度的检测器ICCD对单个羊抗鼠IgG（H+L）分子进行成像，具有非常高的灵敏度，在2.0×10-14mol／L-30×10-14mol／L的浓度范围内，检测到的单分子的数目与溶液浓度有良好的线性关系。
参考文献
[1]Optimization of Gold Nanoparticle-Based DNA Detection for Microarrays[J].Journal of Fluorescence.2005(2)
[2]Modification and characterization of artificially patterned enzymatically active surfaces by scanning electrochemical microscopy[J].Gunther Wittstock.Fresenius’Journal of Analytical Chemistry.2001(4)
[3]Local deposition and characterisation of K2Co[Fe(CN)6]and K2Ni[Fe(CN)6]by scanning electrochemical microscopy[J].Stefan Sauter,Gunther Wittstock.Journal of Solid State Electrochemistry.2001(3)
[4]李菲菲.扫描电化学显微术构建酶图形及全内反射荧光显微术检测鼠IgG[D].山东大学,2007.