背景及概述[1]
15α-羟基左旋乙基甾烯双酮为酮类化合物，是合成目前最为理想的口服避孕药孕二烯酮的关键中间体，现已知其可以通过雷斯青霉对左旋乙基甾烯双酮进行 15,α-羟基化的方法得到。
制备[1]
胡晓杰等人针对真菌培养过程中出现的退化问题,对雷斯青霉采用灭菌胡萝卜作为斜面培养基进行了复壮处理,并通过添加水溶性离子液体的方式提高底物的溶解与传递。操作如下：
1. 菌种与培养基
雷斯青霉(Penicillium raistrickii)ATCC 10490，购自美国典型菌种保藏中心。斜面培养基(g/L)：葡萄糖 20，麦芽提取物 20，蛋白胨 3，琼脂 20，pH 自然，121℃灭菌20,min。发酵培养基 (g/L) ：葡萄糖 30，玉米浆 10 ，NaNO3 2，KH2PO4 1，K2HPO4 2，MgSO4 0.5，FeSO4 0.02，KCl 0.5，pH 7.5，121,℃灭菌 20,min。胡萝卜斜面培养基：将新鲜的胡萝卜纵切开，按试管大小将胡萝卜削成斜面形状，装入试管，115℃灭菌 15min。
2.标准曲线的制作
精密称取干燥至恒质量的 15, 13BETA-乙基-15ALPHA-羟基甾烷-4-烯-3,17-二酮标准品1.0mg 溶于甲醇中，配制成1.0mg/mL 的标准品溶液，并以此母液配制 0.050～0.350mg/mL 的系列标准溶液。
3.菌体的复壮方法
以胡萝卜斜面培养基培养雷斯青霉，按照菌苔厚、颜色等指标选择较优斜面，接入斜面培养基培养。
4.孢子悬浮液制备及甾体转化
孢子悬浮液的制备：用无菌水将菌种斜面制成孢子悬浮液，双层纱布过滤，除去菌丝。利用血球计数板，对单位体积内无菌水中所含有的雷斯青霉孢子数
进行计算。底物投料方式：采用干粉投料，即将底物左旋乙基甾烯双酮粉碎，粒度 14～16µm。在无菌条件下迅速投入已培养好的发酵液中，并加入亲水性离子液体[EMIm][EtOSO3](1-乙基-3-甲基咪唑硫酸乙酯盐)。在发酵液内，采用干粉投料方式加入底物，开始微生物转化。液体发酵培养：摇床转速 180r/min，转化温度为28℃，转化 72～96h 后，料液经过滤，滤液处理后，分析测定转化率。
5.转化产物的检测
用高效液相色谱法(HPLC)分析发酵液中产物13BETA-乙基-15ALPHA-羟基甾烷-4-烯-3,17-二酮的含量。分析条件：Agilent 1100 液相色谱系统，Agilent 色谱工作站，ODS-2HPERSIL 色谱柱，C18 柱 5µm，流动相为甲醇(色谱纯)和水，体积比为 80﹕20，流量为 1mL/min，紫外检测波长为 241nm，柱温为 20℃，进样量为10µL。
结果：经复壮处理后的雷斯青霉对 13BETA-乙基-15ALPHA-羟基甾烷-4-烯-3,17-二酮的产物转化率提高了 26.3%。同时采用水溶性离子液体 1-乙基-3-甲基咪唑硫酸乙酯盐([EMIm][EtOSO3])作为促溶剂，运用到雷斯青霉羟基化甾体化合物左旋乙基甾烯双酮的体系中，并对其摇瓶发酵条件进行优化，在条件下，促溶剂添加量为 4%，底物左旋乙基甾烯双酮投料量为5g/L，投料时间为 30h，转化 72h 后，转化率最高可达 68.1%。
主要参考资料
[1] 胡晓杰,毛淑红,王娜,路福平.雷斯青霉的复壮及水溶性离子液体对其15α-羟基化的影响[J].天津科技大学学报,2012,27(05):7-10.