可逆型蛋白转移膜染色液

背景^[1-3]

可逆型蛋白转移膜染色液适用于快速检测PAGE胶上的蛋白质，它的敏感度比传统的考马斯亮蓝染色法要高1-3倍。可逆型蛋白转移膜染色液可以与抗原（包括外来的和自身的）相结合，从而有效地清除侵入机体内的微生物、寄生虫等异物，中和它们所释放的毒素或清除某些自身抗原，使机体保持正常平衡，但有时也会对机体造成病理性损害，如阻碍抗核抗体、抗双链DNA抗体、抗甲状腺球蛋白抗体等一些自身抗体的产生，对人体可能造成危害。

蛋白质印迹法（免疫印迹试验）即Western Blot。它是分子生物学、生物化学和免疫遗传学中常用的一种实验方法。其基本原理是通过特异性抗体对凝胶电泳处理过的细胞或生物组织样品进行着色。通过分析着色的位置和着色深度获得特定蛋白质在所分析的细胞或组织中表达情况的信息。Western Blot法采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。经过PAGE（聚丙烯酰胺凝胶电泳）分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。该技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达。

应用[4][5]

用于MAPK通路调控下经TGF-β1/Smad信号途径的肝纤维化—肝癌发病机制研究

肝纤维化发病机制的相关研究显示肝星状细胞(HSC)激活与转化是肝脏纤维化形成的关键。而转化生长因子-β1(Transforming growth factor beta-β1)在肝脏纤维化形成的过程中起着非常重要的作用。TGF-β1是促进HSC活化,并促进HSC表达ECM的关键因子。TGF-β1能促进HSC合成弹性蛋白、粘着蛋白、胶原及蛋白聚糖等细胞外基质,减少降解蛋白酶的合成,从而阻止新合成ECM的分解,打破了ECM合成与降解的平衡,使ECM的沉积增多,加速肝脏纤维化的发展。TGF-β1的促纤维化作用主要通过下游Smads家族传递信号,相关研究表明TGF-β/Smad信号途径在肝纤维化的发病机制中发挥了关键作用。此外,除了Smad信号,TGF-β1还可以激活丝裂原活化蛋白激酶(Mitogen activated protein kinase,MAPK)信号转导通路,主要包括c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase,JNK)、细胞外信号调节激酶(Extracellular signal-regulated kinase,ERK)和p38激酶三个亚族。

免疫沉淀与western blot法检测HSC细胞或HepG2细胞内Smad2/3磷酸化以及Smad2/3/4复合物的表达培养结束后提取HSC细胞或HepG2细胞总蛋白,细胞提取物中加入抗-Smad2/3抗体进行免疫沉淀,随后分别利用针对Smad2/3连接区和C-末端磷酸化位点的特异性抗体：抗-pSmad3C、抗-pSmad3L、抗-pSmad2C、抗-pSmad2L),检测细胞内Smad2/3连接区和C-末端磷酸化水平；并利用抗-Smad4抗体检测与Smad2/3结合的Smad4,即Smad2/3/4复合物,以细胞内Smad2/3蛋白和细胞提取物中的Smad4蛋白作为参照。

参考文献

[1]Hepatic stellate cells and extracellular matrix in hepatocellular carcinoma:more complicated than ever[J].Vinicio Carloni,Tu Vinh Luong,Krista Rombouts.Liver Int.2014(6)

[2]Genetic and epigenetic changes in fibrosis‐associated hepatocarcinogenesis in mice[J].Grace Chappell,Kristy Kutanzi,Takeki Uehara,Volodymyr Tryndyak,Hue‐Hua Hong,Mark Hoenerhoff,Frederick A.Beland,Ivan Rusyn,Igor P.Pogribny.Int.J.Cancer.2014(12)

[3]Selection of reference genes for RT-qPCR analysis in tumor tissuesfrom male hepatocellular carcinoma patients with hepatitis B infection and cirrhosis[J].Shuang Liu,Pengfei Zhu,Ling Zhang,Shanlong Ding,Sujun Zheng,Yang Wang,Fengmin Lu.Cancer Biomarkers.2013(5)

[4]Transforming growth factor-β1 impairs CFTR-mediated anion secretion across cultured porcine vas deferens epithelial monolayer via the p38 MAPK pathway[J].Sheng Yi,Fernando Pierucci-Alves,Bruce D.Schultz.AJP:Cell Physiology.2013(8)

[5]谢雷.MAPK通路调控下经TGF-β_1/Smad信号途径的肝纤维化—肝癌发病机制研究[D].安徽医科大学,2014.