背景[1-3]
特超敏ECL化学发光试剂盒是一款具有超高灵敏度的增强型化学发光（ECL）底物，可通过辣根过氧化物酶（HRP）实现低飞克级（fg）的免疫印迹检测。
Super ECL Star特超敏发光液用于检测直接或间接标记辣根过氧化物酶HRP的抗体及其关联的抗原。蛋白质或核酸在电泳后转移到印迹膜上，以HRP标记的抗体或探针结合膜上的目的蛋白或核酸，洗膜后置于用本产品配制的ECL工作液中，室温孵育数分钟，HRP使工作液中的鲁米诺（Luminol）氧化并发光，试剂中添加的增强剂可以使得这种发光大大增强。此光经X光胶片或者电子装置感光记录下来，可清晰显示蛋白质或核酸条带。由于采用了独特的发光底物系统，Super ECL Star超敏发光液是目前最灵敏的商业化荧光ECL检测试剂。
方法步骤
1将印迹膜置于封闭液中，室温轻轻震荡20-60min，以封闭掉非特异性位点。
2弃去封闭液，加入适量的一抗溶液，于摇床上轻轻震荡1h。（也可将印迹膜与一抗在2-8°C条件下孵育过夜。）
3将印迹膜于洗脱液中悬浮清洗5min以上，并更换洗脱液4-6次。
4将印迹膜与适量的HRP-结合物置于摇床上轻轻震荡，室温孵育1h。
5重复步骤3以去除未结合的HRP-结合物
6将A液和B液以1：1混合即得到超敏ECL化学发光工作液，推荐使用量为0.1mL/cm2。将工作液与印迹膜于室温孵育5min。
7将膜从工作液中取出，并用吸水纸吸去多余的液体，置于两层干净的保鲜膜之间，小心挤出印迹膜与保鲜膜之间的气泡。
8将印迹膜置于暗盒中，蛋白面朝上，于暗室中进行X-光胶片曝光。
建议首次曝光时间为60s，进而通过调整曝光时间获得较好的实验结果。
应用[4][5]
用于阻断肾上腺素能受体对人内皮细胞体外血管生成的影响研究
普萘洛尔、酚妥拉明抑制人微血管内皮细胞体外血管生成目的研究离体情况下,p-AR阻断剂普萘洛尔、a-AR阻断剂酚妥拉明对人微血管内皮细胞增殖、迁移、成管及VEGF、VEGFR-2、Ang1、Ang2、Tie-2表达的影响。
方法1.细胞免疫荧光鉴定内皮细胞：细胞采用免疫荧光染色Ⅷ因子进行鉴定。将人皮肤微血管内皮细胞和人脑微血管内皮细胞接种于24孔板爬片。待细胞融合至80%-90%时,4%冰多聚甲醛固定20分钟,0.2%Triton X-100通透10分钟,羊血清封闭30分钟。兔多克隆Ⅷ因子(vWF)一抗4℃湿盒内过夜。TRITC标记的羊抗兔二抗室温孵育2小时(避光)。Hochest(1μg/ml)染核15分钟(避光)后10%甘油封片。正置荧光显微镜下观察、拍片(×200倍)。2.Western blot检测人微血管内皮细胞a-AR的表达：未经药物处理的人皮肤微血管内皮细胞和人脑微血管内皮细胞经裂解获得总蛋白。BCA定量,沸水灭活。取总蛋白约40μg进行SDS-PAGE凝胶电泳后,转移到PVDF膜上。5%BSA封闭1小时,蛋白样品分别在4℃冰箱孵育兔多克隆抗α1-AR、α2-AR一抗过夜。次日在37℃孵箱中孵育相应的二抗1h。采用超敏ECL化学发光试剂盒显色,于暗室内压片,显影定影。
参考文献
[1]Beta‐Adrenoceptor Activation Reduces Both Dermal Microvascular Endothelial Cell Migration via a cAMP‐Dependent Mechanism and Wound Angiogenesis[J].Andrew P.O’Leary,James M.Fox,Christine E.Pullar.J.Cell.Physiol..2015(2)
[2]Extracellular matrix is modulated in advanced glycation end products milieu via a RAGE receptor dependent pathway boosted by transforming growth factor‐β1在晚期糖基化终末产物环境中细胞外基质通过RAGE受体依赖性途径调节，转化生长因子‐β1可以促进这种调节[J].Andreea Iren Serban,Loredana Stanca,Ovidiu Ionut Geicu,Maria Cristina Munteanu,Marieta Costache,Anca Dinischiotu.Journal of Diabetes.2015(1)
[3]Propranolol targets the contractility of infantile haemangioma‐derived pericytes[J].D.Lee,E.Boscolo,J.T.Durham,J.B.Mulliken,I.M.Herman,J.Bischoff.Br J Dermatol.2014(5)
[4]Endoplasmic reticulum stress plays a role in the advanced glycation end product-induced inflammatory response in endothelial cells[J].Lili Wu,Da Wang,Yan Xiao,Xiaoyan Zhou,Liqun Wang,Bo Chen,Qiang Li,Xiaohua Guo,Qiaobing Huang.Life Sciences.2014(1)
[5]潘良利.阻断肾上腺素能受体对人内皮细胞体外血管生成的影响[D].南方医科大学,2016.