背景[1-3]
小鼠肺癌细胞LLC是从小鼠肺癌组织中分离并培养成的稳定原代细胞系，商品化的小鼠肺癌细胞LLC主要来源ATCC、DSMZ、ECACC、RIKEN、LLC小鼠肺癌细胞promocell、ScienCell、ECACC、JCRB、KCLB、Asterand、ICLC等细胞系。
原代培养是直接从生物体获取组织或器官的一部分进行培养，也称初代培养。严格地说即从体内取出组织接种培养到次传代阶段，但实际上，通常把代至第十代以内的培养细胞统称为原代细胞培养。一般持续1一4周。此期细胞呈活跃的移动，可见细胞分裂，但不旺盛。原代培养细胞与体内原组织在形态结构和功能活动上相似性大。由于培养的细胞刚刚从活体组织分离出来，故更接近于生物体内的生活状态。
这一方法可为研究生物体细胞的生长、代谢、繁殖提供有力的手段。同时也为以后传代培养创造条件。最常用的原代培养有组织块培养和分散细胞培养。组织块培养是将剪碎的组织块直接移植在培养瓶壁上，加入培养基后进行培养。分散细胞培养则是将组织块用机械法或化学法使细胞分散。如欲从胎儿或新生儿的组织分离到活性的游离细胞，经典的方法是用蛋白水解酶（如胰蛋白酶和胶原酶）消化细胞间的结合物，或用金属离子螯合剂（如EDTA）除去细胞互相粘着所依赖的Ca2+，再经机械轻度振荡，使之成为单细胞。
应用[4][5]
用于建立稳定表达IL-12的小鼠Lewis肺癌细胞系及IL-12活性检测
白介素-12(interleukin-12,IL-12)是具有抗瘤活性的细胞因子,构建能在真核细胞内稳定表达小鼠白介素-12(murrine interleukin-12 interleukin-12,mIL-12)的质粒,建立稳定表达小鼠IL-12(mIL-12)的小鼠Lewis肺癌(Lewis lung carcinoma,LLC)细胞系LLC/mIL-12,为进一步研究IL-12的免疫调节机制和抗瘤免疫反应奠定基础。
方法:通过聚合酶链反应(PCR)扩增质粒pORF-mIL-12(Elasti,全长),双酶切后将目的片段mIL-12连接到真核表达载体pcDNA3.1(+)质粒上,mIL-12受pcDNA3.1(+)中mCMV启动子驱动,将mIL-12全长转录至同一mRNA上,对重组质粒进行鉴定后用脂质体转染小鼠Lewis肺癌细胞(LLC)测其表达。流式细胞仪(FCM)观察细胞周期和凋亡,G418筛选获得阳性克隆后大量培养并检测mIL-12活性。
结果:PCR成功扩增出mIL-12片段,PCR鉴定、酶切鉴定及测序均证实pcDNA3.1(+)-mIL-12质粒构建成功,RT-PCR及ELISA证实重组质粒在mRNA及蛋白质水平均高表达mIL-12。mIL-12使LLC细胞周期重新分布,并促进其凋亡。LLC/mIL-12细胞培养上清能明显引起刀豆蛋白A(ConA)激活的小鼠脾细胞增殖。
结论:pcDNA3.1(+)-mIL-12真核表达质粒构建成功并能在LLC细胞中稳定表达,成功建立具有mIL-12生物学活性的LLC细胞系。
参考文献
[1]Local administration of IL-12-transfected dendritic cells induces antitumor immune responses to colon adenocarcinoma in the liver in mice.Yuji Satoh,Clemens Esche,Andrea Gambotto,et al.Journal Of Experimental Therapeutics And Oncology.1998
[2]Combining radiation therapy with interleukin-3 gene immunotherapy.Chiang,-C-S,Hong,-J-H,Wu,-Y-C et al.Cancer-Gene-Ther.2000
[3]Adenovirus-medited gene therapy for human head neck squamous cell cancer in a nude mouse model.Mally B W J R,Chen S H,Schwartz M R,et al.Cancer Research.1995
[4]Anaphylactic shock due to recombinant human interleukin-3.Mittelman,-M,Zeidman,-A,Fradin,-Z et al.Eur-J-Haematol.1999
[5]尹晓玲.建立稳定表达IL-12的小鼠Lewis肺癌细胞系及IL-12活性检测[D].重庆医科大学,2006.