背景[1-3]
MKN-45细胞系由S Akiyama建立，源于一位35岁患有印戒细胞癌的女性的胃淋巴结。
MKN-45人胃癌细胞培养操作
1）复苏细胞：将含有1mL细胞悬液的冻存管在37℃水浴中迅速摇晃解冻，加入4mL培养基混合均匀。在1000RPM条件下离心4分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液加入培养瓶中培养过夜（或将细胞悬液加入10cm皿中，加入约8ml培养基，培养过夜）。第二天换液并检查细胞密度。
2）细胞传代：如果细胞密度达80%-90%，即可进行传代培养。
1.弃去培养上清，用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次。
2.加1ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培养瓶中，置于37℃培养箱中消化1-2分钟，然后在显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆并脱落，迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加少量培养基终止消化。
3.按6-8ml/瓶补加培养基，轻轻打匀后吸出，在1000RPM条件下离心4分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养液后吹匀。
4.将细胞悬液按1：2比例分到新的含8ml培养基的新皿中或者瓶中。
3）细胞冻存：待细胞生长状态良好时，可进行细胞冻存。下面T25瓶为类；
1.细胞冻存时，弃去培养基后，PBS清洗一遍后加入1ml胰酶，细胞变圆脱落后，加入1ml含血清的培养基终止消化，可使用血球计数板计数。
2.4 min 1000rpm离心去掉上清。加1ml血清重悬细胞，根据细胞数量加入血清和DMSO，轻轻混匀，DMSO终浓度为10%，细胞密度不低于1x106/ml，每支冻存管冻存1ml细胞悬液，注意冻存管做好标识。
3.将冻存管置于程序降温盒中，放入-80度冰箱，2个小时以后转入液氮灌储存。记录冻存管位置以便下次拿取。
应用[4][5]
用于白藜芦醇通过MEK/ERK信号转导通路抗人胃癌MKN45细胞作用的机制研究
探讨白藜芦醇(Resveratrol)抑制人胃癌细胞株MKN45增殖的作用及其对MEK/ERK(Mitogen-activated Extracellular signal-regulated Kinase/Extracellular Regulated protein Kinases)信号通路的影响,为胃癌临床治疗及新药研发提供数据和思路。
方法:培养良好胃癌细胞株MKN45随机分为四组:对照组(n=6)、MEK/ERK信号通路抑制剂PD98059组(n=6)、白藜芦醇组低剂量组(n=6)、白藜芦醇组高剂量组(n=6)。药物处理:对照组细胞给予DMSO处理,PD98059组细胞给予PD98059(20mg/L,100μL)处理,白藜芦醇组低剂量组(100μmol/L)和白藜芦醇组高剂量组(400μmol/L)处理,各组细胞处理4小时后,用MTT法分析细胞的增殖抑制率;Western blotting法分析凋亡蛋白Bax、Bcl2、Caspase3、Caspase9及MEK/ERK信号通路蛋白Ras、Raf、MEK、ERK1/2等蛋白的表达,细胞免疫荧光化学法分析MEK、ERK1/2蛋白的荧光强度的变化。
结果:1、MTT结果显示:与对照组相比,PD98059组、白藜芦醇低剂量组和白藜芦醇高剂量组细胞在处理1h(P<0.05)、2h(P<0.05)和4h(P<0.05)后细胞的增殖受到明显的抑制。
2、Western blotting结果显示:与对照组相比,PD98059组、白藜芦醇低剂量组和白藜芦醇高剂量组细胞Bax、Caspase3、Caspase9表达明显增强(P<0.05),而Bcl2、Ras、Raf、MEK和ERK1/2表达明显减弱(P<0.05),差异有统计学意义,且作用具有剂量依赖性(P<0.05)。
参考文献
[1]Resveratrol integrates metabolic and growth effects in PC3 prostatecancer cells?involvement of prolyl hydroxylase and hypoxia inducible factor?1[J].Joao Fonseca,Fereshteh Moradi,Lucas Maddalena,Bruna Ferreira?Tollstadius,Shehab Selim,Jeffrey Stuart.Oncology Letters.2019(1)
[2]Combined inhibition of the PI3K/mTOR/MEK pathway induces Bim/Mcl-2-regulated apoptosis in pancreatic cancer cells[J].Burmi,Maginn,Gabra,Stronach,Wasan.Cancer Biology&Therapy.2019(1)
[3]FABP7 promotes cell proliferation and survival in colon cancer through MEK/ERK signaling pathway[J].Ran Ma,Lan Wang,Fang Yuan,Shaoxuan Wang,Yingping Liu,Tingting Fan,Fulai Wang.Biomedicine&Pharmacotherapy.2018
[4]PRMT6 Regulates RAS/RAF Binding and MEK/ERK-Mediated Cancer Stemness Activities in Hepatocellular Carcinoma through CRAF Methylation[J].Lok Hei Chan,Lei Zhou,Kai Yu Ng,Tin Lok Wong,Terence K.Lee,Rakesh Sharma,Jane H.Loong,Yick Pang Ching,Yun-Fei Yuan,Dan Xie,Chung Mau Lo,Kwan Man,Benedetta Artegiani,Hans Clevers,Helen H.Yan,Suet Yi Leung,Stéphane Richard,Xin-Yuan Guan,Michael S.Y.Huen,Stephanie Ma.Cell Reports.2018(3)
[5]邓萍萍.白藜芦醇通过MEK/ERK信号转导通路抗人胃癌MKN45细胞作用的机制研究[D].南华大学,2019.