背景[1-3]
磷酸盐葡萄糖胨水培养基可用于细菌的甲基红和V-P试验。多胨提供碳氮源、维生素和生长因子;葡萄糖为可发酵的糖类;磷酸氢二钾是缓冲剂;氯化钠维持均衡的渗透压。
甲基红(MR)试验：肠杆菌科的细菌在糖代谢过程中，分解葡萄糖，产生丙酮酸，丙酮酸再被分解，生成甲酸、乙酸、乳酸、琥珀酸。大肠杆菌分解丙酮酸，次生的酸类较多，pH为4.5或更低，甲基红呈现红色(阳性)。在产气杆菌的培养液中一部分丙酮酸变为中性的乙酰甲基甲醇，生成的酸类较少，pH在5.4以上，甲基红呈现桔黄色(阴性)。
乙酰甲基甲醇生成试验(V—P试验)：细菌发酵葡萄糖生成丙酮酸，某些细菌可使丙酮酸脱羧形成乙酰甲基甲醇。在碱性溶液中，乙酰甲基甲醇可在空气中氧化成二乙酰(丁二酮)。二乙酰再与蛋白胨中精氨酸的胍基作用，生成红色化合物。试验中加入α—萘酚是作催化剂，使反应的颜色加深，提高反应的敏感性。
应用[4][5]
用于用M-PCR检测闽江流域表面水体中病原性大肠杆菌的毒素基因研究
以闽江流域表体水面中分离出的大肠杆菌为材料,经膜过滤法(membrane filtration method)结合mFC—BCIG培养基的方法来分离粪大肠杆菌,并使用乳糖发酵培养基和磷酸盐葡萄糖胨水培养基来对其进行生化检测,最终确定单位体积水样中粪大肠杆菌的数量,然后将粪大肠杆菌菌株制成PCR模板同时甘油保存。
研究结果表明:对闽江流域从上游到下游7个断面进行了大肠杆菌的分离、鉴定和12种毒素基因的多重PCR检测。在鉴定的1231株粪大肠杆菌中检出10种毒素基因,其中具有扩散性黏附素(aidA-1)毒素基因的大肠杆菌占总数的12.99%,热不稳定肠毒素(elt)和热稳定肠毒素(astA)数量次之(分别占总数的5.8%和5.4%),还检测出了少数高危菌株的主要致病因子,例如志贺氏毒素(Stx2e)和耐药性因子(sepA)等。分别于不同季节在闽江流域福州过境段的洪山桥和解放大桥断面采取水样,进行大肠杆菌的分离、鉴定。
用多重PCR方法对不同季节分离的大肠杆菌毒素基因的时空分布进行定性与定量分析。从分离的2015株粪大肠杆菌中发现840株潜在的致病性大肠杆菌,分别属于肠出血性大肠杆菌(EHEC)、肠聚集性大肠杆菌(EAEC)、肠致病性大肠杆菌(EPEC)和肠产毒性大肠杆菌(ETEC)。
检出的10种毒素基因中,以扩散性黏附素基因(aidA-1)、热稳定性肠毒素基因(astA)和耐药性因子(sepA)为最多;细菌总量、大肠杆菌总数和致病性大肠杆菌总数在冬季较低,春季较多,夏秋季节达到全年数量的高峰;潜在的致病性大肠杆菌的毒素基因的种类和数量也是在冬季最少,春夏季上升,秋季最多。
使用多重PCR(multiplex PCR)的方法对粪大肠杆菌菌株中的毒素基因(virulence gene)进行检测,为闽江河的污染现状和风险评估提供科学依据和技术支撑。
参考文献
[1]Analysis of the AIDA-I gene sequence and prevalence in Escherichia coli isolates from pigs with post-weaning diarrhoea and oedema disease[J].Lixiang Zhao,Xiang Chen,Xiaojing Xu,Gao Song,Xiufan Liu.The Veterinary Journal.2007(1)
[2]Molecular characteristics of Escherichia coli serogroup O78 strains isolated from diarrheal cases in bovines urge further investigations on their zoonotic potential[J].Mol.Nutr.Food Res..2004(7)
[3]Cloning of the Pneumocystis jirovecii trifunctional FAS gene and complementation of its DHPS activity in Escherichia coli[J].Peter Iliades,Daniel J.Walker,Laura Castelli,Jacqueline Satchell,Steven R.Meshnick,Ian G.Macreadie.Fungal Genetics and Biology.2004(12)
[4]DNA inoculation with a plasmid vector carrying the faeG adhesin gene of Escherichia coli K88ab induced immune responses in mice and pigs[J].Carlos Gil Turnes,JoséAntonio G.Aleixo,Alegani Vieira Monteiro,Odir A.Dellagostin.Vaccine.1999(15)
[5]黄文文.用M-PCR检测闽江流域表面水体中病原性大肠杆菌的毒素基因[D].福建师范大学,2009.