背景[1-3]
大鼠血管内皮细胞RAOEC来源于成熟细胞系，经过永生化处理制成传代细胞株，五代传代后细胞活力大于95%。
细胞培养步骤
培养基及培养冻存条件准备：
1）准备培养基；北美胎牛血清，10%；双抗1%。
2）培养条件：气相：空气，95%；二氧化碳，5%。温度：37摄氏度，培养箱湿度为70%-80%。3）冻存液：90%血清，10%DMSO，现用现配。液氮储存。
细胞处理：
1）复苏细胞：将含有1mL细胞悬液的冻存管在37℃水浴中迅速摇晃解冻，加入4mL培养基混合均匀。在1000RPM条件下离心4分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液加入培养瓶中培养过夜（或将细胞悬液加入10cm皿中，加入约8ml培养基，培养过夜）。第二天换液并检查细胞密度。
2）细胞传代：如果细胞密度达80%-90%，即可进行传代培养。对于贴壁细胞，传代可参考以下方法：弃去培养上清，用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次。
1.加2ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培养瓶中，置于37℃培养箱中消化1-2分钟，然后在显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆并脱落，迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加少量培养基终止消化。
2.按6-8ml/瓶补加培养基，轻轻打匀后吸出，在1000RPM条件下离心4分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养液后吹匀。
3.将细胞悬液按1：2到1：5的比例分到新的含8ml培养基的新皿中或者瓶中。
应用[4][5]
用于miR-98靶向Cyclin D2抑制糖尿病大鼠血管内皮细胞增殖的机制研究
miR-98在糖尿病SD大鼠血管内皮细胞增殖中的作用通过建立2型糖尿病大鼠模型,利用Real-time PCR检测miR-98在糖尿病大鼠血管内膜组织中的表达明显低于正常大鼠组织,推测miR-98在血管内皮细胞增殖中发挥作用。
进一步Western blotting检测Cyclin D2的表达,其在糖尿病大鼠血管内膜组织中的表达明显高于正常大鼠组织,与cyclinD2相关的p-Rb表达升高,结果提示,cyclin D2和与其相关的Rb的磷酸化在血管内皮细胞增殖中发挥重要作用。在细胞水平,MTT检测高糖处理对RAOEC细胞增殖的影响,结果显示,高糖处理组细胞的增殖率明显高于低糖处理组。
进一步检测高糖处理细胞后对细胞周期的影响,与高糖培养基处理组相比,正常组的细胞主要停滞在G1期,而高糖处理组的细胞主要进行分裂增殖。通过Real-time PCR检测高糖处理细胞后miR-98的表达,高糖处理组miR-98的表达明显低于低糖处理组（对照组）。
进一步Western blotting检测Cyclin D2和p-Rb在高糖处理组的表达明显高于低糖处理组,结果显示,cyclin D2和与其相关的Rb的磷酸化在血管内皮细胞增殖中发挥重要作用。
参考文献
[1]Role of MicroRNAs in Prostate Cancer Pathogenesis[J].You-Lin Wang,Shuai Wu,Bo Jiang,Fu-Fen Yin,Shuai-Shuai Zheng,Si-Chuan Hou.Clinical Genitourinary Cancer.2015(4)
[2]Role of microRNAs-29b-2,?<ce:hsp sp="0.10"/>155,?<ce:hsp sp="0.10"/>197 and?<ce:hsp sp="0.10"/>205 as diagnostic biomarkers in serum of breast cancer females[J].Olfat Shaker,Moataz Maher,Yasser Nassar,George Morcos,Ziad Gad.Gene.2015(1)
[3]Oxidative stress and its association with TNF-α-308 G/C and IL-1α-889 C/T gene polymorphisms in patients with diabetes and diabetic nephropathy[J].Brijesh Dabhi,Kinnari N.Mistry.Gene.2015(2)
[4]Circulating Micro-RNAs as Diagnostic Biomarkers for Endometriosis:Privation and Promise[J].Warren B.Nothnick,Ayman Al-Hendy,John R.Lue.The Journal of Minimally Invasive Gynecology.2015(5)
[5]李新新.miR-98靶向Cyclin D2抑制糖尿病大鼠血管内皮细胞增殖的机制[D].滨州医学院,2015.