背景[1-3]
HCCLM3细胞是一种人肝癌转移细胞株，具有较高的转移潜能，是用人肝癌细胞株MHCC97-H接种裸鼠，进行3次肺转移筛选，取肺转移瘤建成皮下接种后高度自发性肺转移的肝癌细胞系。
HCCLM3(人高转移肝癌细胞)操作流程
1.细胞收到后建议在培养箱稳定4小时左右再依据细胞密度，换液培养或传代。
2.如果细胞为贴壁细胞，而收到时呈悬浮或者部分悬浮的状态，请将悬浮的细胞及时离心，加15%血清的完全培养基到新的培养皿/瓶中继续培养3天；同时原培养瓶中剩下的贴壁细胞更换为15%血清的完全培养基，培养2-3天。若3天后细胞都没有出现增殖而是继续脱落死亡，请及时联系实验室，技术人员会跟进解决。
3.贴壁细胞生长缓慢：适当提高血清浓度（最高不超过20%），或可根据该细胞生长密度，考虑胰酶消化后，转移到新的培养瓶继续培养。
4.生长不均：贴壁细胞若出现生长不均，成岛状生长，可将细胞进行消化，重新打散细胞，加入新鲜培养基进行培养。
HCCLM3(人高转移肝癌细胞)常规培养传代流程（请严格遵守无菌操作）
1.吸出原培养瓶中的培养基，PBS缓冲液润洗细胞两次，加1~2 ml 0.25%EDTA的胰酶消化（注意把握消化时间，通常控制在1~2min）。
2.镜下观察消化情况，在细胞边缘缩小，贴壁运动时（不建议消化到细胞漂浮）去掉胰酶，加6~8ml完全培养基，轻轻吹打细胞层，尽量把细胞层吹落、吹散。
3.取出部分细胞悬液转移到新的培养皿/瓶中，添加适当的完全培养基，于培养箱中培养。
4.注意培养基PH值变化情况，定期换液，待细胞密度达到70-80%时重复传代操作或者冻存。
应用[4][5]
用于CRABP2基因在肝癌的表达及对肝癌HCCLM3细胞恶性生物学行为的影响研究
探讨了CRABP2在转移性肝癌细胞HCCLM3中的生物学作用及可能的机制，以期明确CRABP2是否能作为肝癌基因治疗的一个新的治疗靶点。
方法:1.采用Real Time-PCR和Western Blot检测肝癌细胞（HCCLM3、Huh7、Hep3B、HepG2）和人肝细胞L02中CRABP2的mRNA和蛋白的表达。
2. 免疫组化方法检测人肝癌和癌旁的组织芯片，比较CRABP2在肝癌组织与癌旁组织的表达。
3. 设计并合成针对CRABP2基因的siRNA，分别在siRNA干扰HCCLM3细胞48h和72h后提取RNA和蛋白质，通过Real time PCR和Western Blot检测干扰效率。
4. CCK-8法检测siRNA干扰CRABP2对HCCLM3细胞体外增殖的影响；流式细胞仪检测siRNA干扰CRABP2对HCCLM3细胞凋亡和周期的影响；使用BD公司生产的8μm孔径的24孔板用培养小室检测siRNA干扰CRABP2后HCCLM3细胞的体外迁移和侵袭能力变化。
5. 构建CRABP2shRNA稳定干扰逆转录病毒载体及阴性对照载体并稳定感染肝癌细胞株HCCLM3：利用逆转录病毒载体pMKO.1构建出干扰CRABP2的pMKO.1-CRABP2shRNA，选用293T细胞进行病毒包装，将病毒载体感染HCCLM3细胞，通过测序和western blot检测，建立起稳定的CRABP2基因shRNA干扰HCCLM3细胞株。
6. 构建CRABP2慢病毒过表达载体并稳定感染肝癌细胞株HCCLM3：利用慢病毒载体pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP构建出过表达CRABP2的pCDH-CRABP2，选用293T细胞进行病毒包装，将病毒载体感染HCCLM3细胞，通过测序和western blot检测，建立起稳定的CRABP2基因过表达HCCLM3细胞株。
7. 利用CRABP2shRNA稳定干扰的HCCLM3细胞株，建立裸鼠皮下移植瘤，研究了CRABP2基因干扰对HCCLM3细胞体内成瘤能力和生长、增殖的影响，western blot检测了瘤块的CRABP2蛋白表达情况。
8. 采用Western blot方法检测了病毒稳定干扰和稳定过表达CRABP2后HCCLM3细胞株的MAPK信号通路、Cyclins/CDKs、VCAM1、ADH1C、c-Myc、NF-κB的蛋白水平表达变化。稳定干扰实验分为阴性对照组pMKO.1-NC和稳定干扰组CRABP2shRNA；稳定过表达实验分为空载体组pCDH-Vector和稳定过表达组pCDH-CRABP2。
9.Real-time PCR进一步验证CRABP2稳定干扰和过表达时蛋白表达水平改变的基因mRNA变化，包括CDK2、Cyclin E1、CDK4、CDK6、Cyclin D1、MKK4、JNK、c-Jun、VCAM1及ADH1C。
参考文献
[1]A Liver Full of JNK:Signaling in Regulation of Cell Function and Disease Pathogenesis,and Clinical Approaches[J].Ekihiro Seki,David A.Brenner,Michael Karin.Gastroenterology.2012(2)
[2]Proteomic analysis of infiltrating ductal carcinoma tissues by coupled 2-D DIGE/MS/MS analysis[J].K.Davalieva,S.Kiprijanovska,C.Broussard,G.Petrusevska,G.Efremov.Molecular Biology.2012(3)
[3]Proteomic characterization of ovarian cancers identifying annexin‐A4,phosphoserine aminotransferase,cellular retinoic acid‐binding protein 2,and serpin B5 as histology‐specific biomarkers[J].AtsushiSuzuki,ChikageAoki,YukariUmino,DaisukeAoki.Cancer Sci.2012(4)
[4]Epigenetically mediated downregulation of the differentiation‐promoting chaperon protein CRABP2 in astrocytic gliomas[J].Benito Campos,Rolf Warta,Jittiporn Chaisaingmongkol,Lea Geiselhart,Odilia Popanda,Christian Hartmann,Andreas von Deimling,Andreas Unterberg,Christoph Plass,Peter Schmezer,Christel Herold‐Mende.Int.J.Cancer.2012(8)
[5]郭颖.CRABP2基因在肝癌的表达及对肝癌HCCLM3细胞恶性生物学行为的影响[D].重庆医科大学,2014.