背景[1-3]
人角膜上皮细胞分离自眼角膜组织；角膜系眼球外膜呈半球形向前突出的部分。占外膜的1/6，横为椭圆形，约11.5～12mm，垂直径约10.5～11mm，厚约1mm，中央部稍Chemicalbook薄约0.8mm；前面曲率半径均值为7.8mm，后面为6.8mm。角膜由致密结缔组织组成，可分为5层，即上皮细胞层、前弹力层、基质层、后弹力层及内皮细胞层。
角膜上皮细胞的体外培养对研究角膜的生理学、病理学、免疫学以及分子生物学都是极为重要的手段，常用于研究细胞代谢产物、病毒感染、各种生长因子和药物对细胞生长的影响。
人角膜上皮细胞体外培养：
1.将供体角膜放于消毒过的容器上，上皮面朝上，用手术刀切成12个三角形组织片。应一刀切下，避免锯割。如此仔细处理角膜可减少对胶原基质的破坏和成纤维细胞的脱落。
2.将角膜组织片的上皮面朝向下，放入用鼠尾Ⅰ型胶原蛋白预处理的6孔培养板，每孔放4个组织块。
3.用镊子轻压组织片，以便使组织块与培养皿表面充分接触。将组织片放置20min，使其变干。
4.将一滴KGM轻轻滴于组织片上，在37℃和5%CO2条件下孵育过夜。尽管从眼库得到的供体角膜是用抗菌素的培养液保存的，但全部操作应在无菌条件下进行。
5.第2d，在培养皿中加入1ml培养液。在培养早期，可观察到细胞仅从角膜缘处迁出，但没有细胞从角膜或虹膜迁出。无血清培养液含有低浓度钙离子（0.15mmol/L），减少胶原基质降解，故这种培养液可减少成纤维细胞长出。
6.在植入角膜组织片后第5d，用镊子将组织片取出，再加入3ml培养液。取出组织片后，贴壁细胞继续增值。第2周，细胞生长形成单层，呈现上皮具有的典型卵石状排列特征。每个角膜约获得6×106个上皮细胞。每周换液2次。
7.扩增培养：取出组织片后，当细胞融合达70%-80%时，用PBS浸洗细胞。然后，在37℃条件下用胰蛋白酶-EDTA液处理4min。用含有10%FBS的PBS终止消化。将细胞离心后，用KGM混悬。计数细胞，以1×104个/cm2密度将细胞接种于涂有FNC的培养皿。在37℃、5%CO2条件下培养。1d后换培养液。
应用[4][5]
用于IL-1β诱导人角膜上皮细胞产生IL-6和IL-8的分子机制及地塞米松对其抑制作用的研究
IL-1β诱导HCECs产生IL-6和IL-8的分子机制,主要以三条经典的MAPKs信号通路,即ERK,p38和JNK信号通路,以及转录因子NF-κB为分子靶点,研究其在IL-1β诱导HCECs产生IL-6和IL-8中的作用以及IL-1β活化的三条MAPKs信号通路与IL-1β诱导的NF-κB亚基p65入核和IL-1β上调的NF-κB转录活性之间的内在联系。
方法：通过实时定量聚合酶链反应（qPCR）技术检测给予和不给予IL-1β刺激的HCECs IL-6和IL-8 mRNA水平,以及抑制三条MAPKs信号通路和转录因子NF-κB后,再给予IL-1β刺激的HCECs IL-6和IL-8 mRNA水平。
采用Western blot技术检测给予和不给予IL-1β刺激的三条经典的MAPKs信号通路及NF-κB抑制因子IκBα的磷酸化水平。通过细胞免疫荧光染色技术检测给予和不给予IL-1β刺激的HCECs NF-κB亚基p65的亚细胞定位以及分别单独抑制三条MAPKs信号通路后再给予IL-1β刺激的HCECs p65的亚细胞定位；行双荧光素酶报告基因检测技术检测给予和不给予IL-1β刺激的HCECs NF-κB的转录活性及分别单独抑制三条MAPKs信号通路后再给予IL-1β刺激的HCECs NF-κB的转录活性。
参考文献
[1]Interleukin‐1β/Iinterleukin‐1 receptor‐associated kinase 1 inflammatory signaling contributes to persistent Gankyrin activation during hepatocarcinogenesis[J].Bo Su,Tao Luo,Junjie Zhu,Jing Fu,Xiaofang Zhao,Lei Chen,Huilu Zhang,Yibin Ren,Lexing Yu,Xiaojun Yang,Mengchao Wu,Gensheng Feng,Shao Li,Yao Chen,Hongyang Wang.Hepatology.2015(2)
[2]Interleukin-6 and its receptors:A highly regulated and dynamic system[J].Janina Wolf,Stefan Rose-John,Christoph Garbers.Cytokine.2014(1)
[3]LPS-and LTA-Induced Expression of IL-6 and TNF-αin Neonatal and Adult Blood:Role of MAPKs and NF-κB[J].Lutz Koch,David Frommhold,Kirsten Buschmann,Navina Kuss,Johannes Poeschl,Peter Ruef,Fulvio D’Acquisto.Mediators of Inflammation.2014
[4]IL-1βUpregulates IL-8 Production in Human Müller Cells Through Activation of the p38 MAPK and ERK1/2 Signaling Pathways[J].Xiufen Liu,Fei Ye,Huabao Xiong,Danning Hu,G.Astrid Limb,Tian Xie,Liang Peng,Wei Yang,Yabin Sun,Mingming Zhou,E Song,David Y.Zhang.Inflammation.2014(5)
[5]周卫萍.IL-1β诱导人角膜上皮细胞产生IL-6和IL-8的分子机制及地塞米松对其抑制作用的研究[D].浙江大学,2015.