背景及概述[1]
左旋肉碱或L-肉碱，别称L-肉毒碱或维生素BT，其化学名称为β-羟基γ-三甲铵丁酸，是一种白色晶状体或白色透明细粉。肉碱的研究始于20世纪初期。1905年，俄国人Gulewitsch和Krimberg从肉类提取物中发现了L-肉碱。自此以后，各国科学家进行了深入的研究，早期的研究发现，L-肉碱是一种类维生素营养素，并将其命名为维生素BT。而事实上，肉碱的化学结构类似于胆碱，与氨基酸相近；另外，由于一些动物可由自身合成来满足肉碱的需要，因此认为肉碱不是维生素，但习惯上仍将其称为维生素BT。实验表明L-肉碱是一种必需营养素，1985年在芝加哥召开的国际营养学术会议上，将左旋肉碱指定为“多功能营养品”。
制备[1]
步骤1：催化剂[RuCl(cymene)(S-BINAP)]Cl的制备。
取市场上采购的手性配体S-BINAP(0.535g，0.85mmol)和钌化合物[Ru(p-cymene)Cl2]2(0.29g，0.47mmol)于三颈瓶中，在N2保护下加入无水乙醇60mL和CH2Cl220mL，升温至50-60℃搅拌反应20h，减压除溶剂后，得0.87g红棕色产物[RuCl(cymene)(S-BINAP)]Cl[氯代[(S)-(-)-2，2′-双(二苯基膦)-1，1′-联萘](p-伞花素)氯化钌(II)]。
步骤2：中间体(R)-(-)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯的制备。
取80g的4-氯乙酰乙酸乙酯于装备聚四氟衬管的高压釜中，将高压釜封闭好后，用5kgf/cm2的纯H2(99.99％)洗高压釜10余次后，向高压釜中充氢待用。在H2气氛下将催化剂[RuCl(cymene)(S-BINAP)]Cl(30mg)溶解于300mL的乙酸乙酯溶液中，用注射器小心将其加入高压釜中，继续充氢至5kgf/cm2后，升温至80℃左右，静置约20min后，开始搅拌，在此温度下反应6h后，停止反应，取出物料后经减压蒸馏除去低级烷基酯类溶剂即得高纯度产品。经GC分析产物。转化率大于99％，ee值96％。
步骤3：左旋肉碱的制备。
取上述产物-4-氯-3-羟基丁酸乙酯(4.5g)于圆底烧瓶中，加入33％Me3N20mL，用翻口橡皮塞密封，升温至80℃，搅拌反应5h，停止反应，减压蒸馏除去未反应的Me3N后，加入10％的盐酸溶液40mL，继续在100℃下搅拌反应6h，冷至室温，加入CH2Cl220mL，室温下搅拌过夜，分离收集水溶液，真空旋干，得棕褐色粘稠状粗产物。
取预先制备好的阴离子交换树脂约200-300mL，参照硅胶湿法装好树脂柱，在顶层小心放置一层玻璃纤维，将上述粘稠状粗产物倒入装好的柱中，用去离子水淋洗，控制滴液速度大约为1-2mL/min，当流出溶液的pH＞8时开始收集，收集至流出液的pH约为8时停止收集。将所得的溶液减压抽干。用乙醇/丙酮(1/7)重结晶，得到无色针状晶体(左旋肉碱)，将所得肉碱产品于60-80℃下真空干燥1-2小时即得纯品，产量4.0g，收率为86％。测定上述所得产品的比旋光度为，[α]D23-30.1。
含量检测[2]
1、试剂准备
高氯酸溶液(13％)：13mL高氯酸稀释至100mL。
氢氧化钠溶液(10mol/L)：称取40g氢氧化钠用水溶解，冷却后稀释至100mL。
氢氧化钾溶液(4.0mol/L)：称取22.4g氢氧化钾用水溶解，冷却后稀释至100mL。
显色储备液：分别称取50mg2-硝基苯甲酸、5.96gN-2-羟乙基哌嗪-N-2-乙烷磺酸、185mg乙二胺四乙酸二钠溶于30mL去离子水中，用10mol/LNaOH溶液调pH至7.4～7.6，然后用水定容至50mL。此液置于4℃冰箱中可保存3个月。
显色工作液：吸取5.0mL显色储备液用水定容至25mL。
乙酰辅酶A(AcetylCoA)溶液：20.0mg乙酰辅酶A溶于2.0mL水中。临用时配制。
乙酰肉碱转移酶(CAT)溶液：吸取10μL乙酰肉碱转移酶悬浮液，经1500r/min离心10min，弃去上层清液，沉淀用0.2mL水溶解。临用时配制。
左旋肉碱标准品，sigma，纯度99％。配制成5个浓度备用，现配现用，分别是1.6，3.2，6.4，9.6，16ug/ml。
2、仪器
分析天平：万分之一。
pH计：精度0.01。
离心机：转速≥1500r/min。
恒温水浴锅：温度可控制在40℃±2℃。
酶标仪405nm及配套的96孔酶标板。
3、样品处理
准确称取2.5g混合均匀的试样于带刻度的50ml离心管中，用15mL40℃温水溶解。加入5mL13％高氯酸溶液，混合均匀后静止20min。用蒸馏水定容至刻度，混匀，用定量滤纸过滤。
取滤液20mL，用4mol/L氢氧化钾溶液调pH为12.5～13.0后，置于40℃水浴60min。冷却后用13％高氯酸调pH为7.0～7.5。将样液转入50mL容量瓶中，用蒸馏水定容。混匀后置于4℃冰箱中过夜。将试样处理液从冰箱中取出放置至室温，取上清液测定。
4、分析测定
在酶标板上设置标准孔5个(1.6，3.2，6.4，9.6，16)和样品孔，双孔平行测试；
取200ul标品或样品加入到相应的微孔中；
加入80ul底物到各个孔，加入10ul辅酶A到各个孔。轻轻混匀，立刻开始计时5分钟，室温；
在405nm读取吸光度OD1；
每孔加入10ul转移酶溶液，混匀(轻轻搅拌效果好)，计时10分钟，室温；
用酶标仪405nm测试吸光度OD2。
5、结果计算
用吸光度差(OD2-OD1)作纵坐标，浓度值为横坐标，作图，从图中读出样品浓度，乘以稀释倍数(稀释倍数50)得最终结果。
本方法对国标法进行了改进，使得左旋肉碱测定更加快捷方便。一是本方法所用到的试剂属于酶类制剂，价格比较高，用酶标板孔进行反应所需的试剂量是原来的十分之一，可以大大节约关键试剂的用量及成本。二是本发明方法可以一次性测试96孔的吸光度，节省很多时间，而分光度计每次只能测一个样的吸光度值，因而能达到一个快速检测的目标，例如测定10个样品时，本发明方法相对国标法可以节省210分钟。
参考文献
[1][中国发明,中国发明授权]CN201210089733.8一种左旋肉碱的制备方法
[2][中国发明]CN201810498612.6一种乳粉中左旋肉碱含量的检测方法